Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

يشكر المؤلفون المشاركين في الدراسة الذين جعلوا هذا البحث ممكنا وكرسوا هذا التقرير للعلماء الجدد في مجال هشاشة العظام.

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا واتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية التي وضعها مجلس المراجعة المؤسسية لنظام هنري فورد الصحي (IRB # 13995).
1. اختيار المريض
<ol><li>تحديد المرضى من بين أولئك الذين من المقرر أن يخضع TKA مع جراح العظام.</li>
	<li>حدد المرضى بناء على معايير الأهلية المحدد?...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

وقد أثبت البروتوكول المقدم نجاحه في جمع سبعة أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية لاستخراج الحمض النووي الريبي(الجدول 1)والمعالجة النسيجية(الشكل 4). قبل جمع عينات المرضى، من الضروري وضع بروتوكول معتمد من قبل مجلس الهجرة والريب، بالتعاون المثالي مع جراح أو فريق ج...

الركبة هي أكبر مفصل زليلي في جسم الإنسان ، ويتألف من المفصل التكافلي بين الساق وعظم الفخذ والمفصل الرضفة بين الرضفة وعظم الفخذ1. تصطف العظام في الركبة مع غضروف المفصلي وبدعم من الأنسجة الضامة المختلفة، بما في ذلك الغضروف المفصلي والدهون والأربطة والعضلات، وغشاء الزليلي يلف المفصل كله لإنشاء تجويف مملوء بالسوائل الزليلية1،2،3 ( الشكل1). وظائف الركبة صحية كمفصل المفصلي المحمول الذي يسمح الحركة الاحتكاك في الطائرة الأمامية1،3. في ظل الظروف المرضية ، يمكن أن تصبح الحركة مقيدة ومؤلمة. مرض مفصل الركبة التنكسية الأكثر شيوعا هو هشاشة العظام (OA)4. ومن المعروف أن مجموعة متنوعة من عوامل الخطر مهيأة لتطوير الزراعة العضوية، بما في ذلك كبار السن والسمنة والجنس الأنثوي والصدمات النفسية المشتركة وعلم الوراثة، من بين أمور أخرى5،6. هناك حاليا ما يقدر بنحو 14 مليون شخص في الولايات المتحدة الأمريكية يعانون من أعراض الزراعة العضوية في الركبة ، مع زيادة انتشار بسبب ارتفاع سن السكان ومعدلات السمنة7،8. يعتبر في البداية أن يكون مرض الغضروف، الزراعة العضوية هو الآن يفهم على أنه مرض المفصل كله9. التغيرات المرضية التي لوحظت عادة في الزراعة العضوية تشمل تآكل الغضاريف المفصلية ، وتشكيل العظام ، وسماكة العظام تحت الوخز ، والتهاب الزليلي9،10. نظرا لعدم وجود علاج معروف ل OA ، تركز العلاجات في المقام الأول على إدارة الأعراض (على سبيل المثال ، الألم)11،12، وبمجرد تقدم الزراعة العضوية إلى المرحلة النهائية ، غالبا ما يشار إلى جراحة استبدال المفاصل13.
يمكن أن تكون جراحات استبدال المفاصل إما استبدال جزئي أو كلي للركبة ، مع رأب مفصل الركبة الكلي (TKA) بما في ذلك استبدال التعبير التكافلي الكامل والمفصل الرضفة. اعتبارا من عام 2020 ، يتم تنفيذ ما يقرب من 1 مليون TKAs في الولايات المتحدة الأمريكية كل عام14. خلال TKA، جراح العظام resects الجزء العلوي من الهضبة الظنبوبية والكونديلز الفخذ السفلي (الشكل 2A، 2B) لتكون مزودة يزرع الاصطناعية. يساء تفسيرها في بعض الأحيان من قبل المرضى، في TKA، يتم استئصال فقط 8-10 ملم من نهاية كل عظمة، والتي توج في وقت لاحق أو تطفو على السطح، مع المعدن. تشكل بطانة البولي إيثيلين المتشابكة سطح الحامل (أي الحشو) بين الغرستين المعدنيتين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استئصال العديد من مكونات الأنسجة الرخوة في المفصل بشكل كامل أو جزئي لتحقيق التوازن السليم للمفاصل. من بين هذه الأنسجة هي الوساطة والحروف المفصلي الجانبي (الشكل 2C)، وسادة الدهون تحتباتيلور (الشكل 2D)، الرباط الصليبي الأمامي (ACL؛ الشكل 2E), الزليلية (الشكل 2F), وs vastus العضلات المائلة (VMO; الشكل 2G) 15.على الرغم من أن TKAs ناجحة عموما لعلاج الزراعة العضوية, حوالي 20٪ من المرضى تقرير تكرار الألم بعد الجراحة16. جنبا إلى جنب مع ارتفاع تكلفة والتوغل النسبي للإجراء، وهذه القيود تشير إلى الحاجة إلى مزيد من البحوث لتحديد العلاجات البديلة للتخفيف من تطور الزراعة العضوية.
لاستكشاف آليات المرض في الزراعة العضوية التي قد تقدم سبلا جديدة للتدخل العلاجي ، يمكن استخدام النظم التجريبية ، بما في ذلك الخلايا ، والنباتات الأنسجة ، والنماذج الحيوانية. وعادة ما يتم استزراع الخلايا في طبقة أحادية وتستمد من الأنسجة البشرية أو الحيوانية الأولية (على سبيل المثال، الشوندروسيتيات المعزولة عن الغضاريف) أو الخلايا الخالدة (على سبيل المثال، ATDC517 و CHON-00118). في حين أن الخلايا يمكن أن تكون مفيدة لمعالجة المتغيرات التجريبية في بيئة الثقافة الخاضعة للرقابة، فإنها لا تلتقط ظروف المفصل الطبيعي التي من المعروف أنها تؤثر على الأنماط الظاهرية للخلايا19. لتلخيص أفضل لسلسلة معقدة من الاتصالات الكيميائية والميكانكية ، وخلايا إلى خلايا الكامنة وراء الزراعة العضوية ، تم العثور على بديل في عينات الأنسجة البشرية أو الحيوانية الأولية ، سواء كانت تستخدم الطازجة أو المستزرعة ex vivo كما explants ، للحفاظ على هيكل الأنسجة والبيئة الدقيقة الخلية20. من أجل دراسة المفصل في الجسم الحي، صغيرة (على سبيل المثال ، الماوس21)وكبيرة (على سبيل المثال ، الحصان22)نماذج حيوانية ل OA (على سبيل المثال ، من خلال الاستقراء الجراحي ، والتغيير الوراثي ، أو الشيخوخة) مفيدة أيضا. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الترجمة من هذه النماذج إلى الأمراض البشرية محدودة بسبب الاختلافات التشريحية والفسيولوجية والأيضية ، من بين أمور أخرى23. وبالنظر إلى مزايا وعيوب النظم التجريبية، فإن نقاط القوة الرئيسية لكونها خاصة بالأنواع والحفاظ على مكانة خارج الخلية التي تقدمها أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية تزيد من الإمكانات التحويلية لنتائج البحوث.
يمكن الحصول على أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية بسهولة بعد TKA ، مما يجعل التردد العالي ل TKAs موردا قيما للبحث. ومن بين التطبيقات التجريبية المحتملة التعبير الجيني والتحليلات النسيجية. لتحقيق إمكانات أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية لهذه النهج البحثية وغيرها ، والخطوط العريضة هي الاعتبارات الرئيسية التالية. أولا، يخضع استخدام عينات المرضى للتنظيم الأخلاقي، ويجب أن تفي البروتوكولات بموافقات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB)24. ثانيا، إن التغاير المتأصل في الأنسجة البشرية المريضة الأولية وتأثير المتغيرات مثل العمر والجنس، من بين أمور أخرى، يخلق الحاجة إلى اختيار دقيق للمرضى (أي تطبيق معايير الأهلية) وتفسير البيانات. ثالثا، يمكن أن تشكل الخصائص البيولوجية الفريدة لمختلف الأنسجة في المفصل (مثل انخفاض الخلايا في الغضاريف والغضروف المفصلي25)تحديات أثناء التجارب (على سبيل المثال، عزل الجودة العالية وكمية الحمض النووي الريبي). ويتناول هذا التقرير هذه الاعتبارات ويقدم بروتوكولا لاختيار المرضى ومعالجة العينات وتجانس الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة (أي تقييم نقاء الحمض النووي الريبي وسلامته؛ الشكل 3) لتشجيع استخدام أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية في مجتمع البحوث.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

هشاشة العظام (OA) هو مرض مزمن وتنكسي مشترك يصيب الركبة في معظم الأحيان. وبما أنه لا يوجد علاج في الوقت الحالي، فإن رأب مفصل الركبة الكلي (TKA) هو تدخل جراحي شائع. التجارب باستخدام أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية التي تم الحصول عليها من TKA توفر القدرة على التحقيق في آليات المرض في الجسم الحي السابق. في حين كان يعتقد سابقا أن الزراعة العضوية تؤثر أساسا الغضروف، ومن المعروف الآن أن تؤثر على أنسجة متعددة في المفصل. يصف هذا البروتوكول اختيار المريض ومعالجة العينات وتجانس الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة (استنادا إلى نقاء الحمض النووي الريبي وسلامته وعائده) من كل من الأنسجة السبعة الفريدة لدعم التحقيق في آلية المرض في مفصل الركبة. وبرضاء مستنير، تم الحصول على عينات من المرضى الذين يخضعون ل TKA من أجل الزراعة العضوية. تم تشريح الأنسجة وغسلها وتخزينها في غضون 4 ساعة من الجراحة عن طريق تجميد فلاش للجيش الملكي النيبالي أو تثبيت الفورمالين لعلم الأنسجة. وشملت الأنسجة التي تم جمعها الغضروف المفصلي، والعظام تحت الوخز، الغضروف المفصلي، وسادة الدهون infrapatellar، الرباط الصليبي الأمامي، الزليلي، والعضلات المائلة vastus الوسطى. تم اختبار بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي لكل نوع من أنواع الأنسجة. وشملت التعديل الأكثر أهمية طريقة التفكك المستخدمة في الأنسجة المنخفضة الخلية، عالية المصفوفة، والأنسجة الصلبة (تعتبر الغضاريف والعظام والغضروف المفصلي) مقابل الأنسجة الرخوة عالية الخلية نسبيا، منخفضة المصفوفة (تعتبر وسادة الدهون، الرباط، الزليلية، والعضلات). ووجد أن النبض مناسب للأنسجة الصلبة، وأن التجانس مناسب للأنسجة الرخوة. ولوحظ ميل لبعض المواضيع إلى تحقيق قيم أعلى من عدد نزاهة الحمض النووي الريبي (RIN) من الموضوعات الأخرى باستمرار عبر أنسجة متعددة، مما يشير إلى أن العوامل الكامنة مثل شدة المرض قد تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي. توفر القدرة على عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة عن أنسجة الزراعة العضوية البشرية الأولية نموذجا ذا صلة فسيولوجية لتجارب التعبير الجيني المتطورة ، بما في ذلك التسلسل ، والتي يمكن أن تؤدي إلى رؤى سريرية تترجم بسهولة أكبر إلى المرضى.

سبعة فريدة من نوعها أنسجة مفصل الركبة البشرية متاحة لجمع من المرضى الذين يخضعون ل TKA لOA (الشكل 1). في هذا البروتوكول، تم تحديد كل من هذه الأنسجة ومعالجتها في غضون 4 ساعة من الاستئصال الجراحي(الشكل 2). بعد الخطوات المبينة في الشكل 3، كانت أجزاء من...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

الأنسجة الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى بعد رأب مفصل الركبة الكلي توفر نموذجا تجريبيا لأبحاث هشاشة العظام مع أقصى قدر من الترجمة السريرية. يصف هذا البروتوكول كيفية تحديد ومعالجة وعزل الحمض النووي الريبي من سبعة أنسجة ركبة فريدة من نوعها لدعم التحقيق الميكانيكي في هشاشة العظام البشرية.

جمع الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي من مفصل الركبة هشاشة العظام البشرية

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

يشجع هذا البروتوكول على استخدام الأنسجة البشرية الأولية كنموذج ذي صلة سريريا لأبحاث هشاشة العظام. قد يوفر إجراء التعبير الجيني والتحليلات النسيجية في هذه الأنسجة رؤى ميكانيكية جديدة. هذه التقنية توحيد أساليب لتحديد ومعالجة مكونات مفصل الركبة البشرية.وهو يتيح استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة التي تلبي متطلبات المقايسات التعبير الجيني المصب. من الصعب الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من أنسجة المفاصل المريضة ، لذلك لا ينبغي التقليل من أهمية الخطوات التي تبدو تافهة ، مثل الحفاظ على كل شيء نظيف وبارد. إثبات الإجراء سيكون توماس ويلسون، باحث مشارك ونافيديب كاور، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري.ابدأ بتحديد الأنسجة الصلبة ، بما في ذلك الغضاريف والعظام والغضروف المفصلي والأنسجة الرخوة ، بما في ذلك وسادة الدهون تحت الصوتية ، الرباط الصليبي الأمامي ، الزليلي والعضلات المائلة الشاسعة الوسطى من العينة استنادا إلى الاختلافات في الحجم والشكل واللون والملمس. قطع كل من الأنسجة إلى ثلاثة أقسام. شطف أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة أي بقايا أو حطام.لاستخراج الحمض النووي الريبي، وقطع كل من أقسام الأنسجة الثلاثة إلى ما يقرب من مكعبات 1-2 ملليمتر. نقل القطع الصغيرة إلى قارورة بكريو ملليلتر اثنين. بعد تأمين القبعات بإحكام، فلاش تجميد قوارير عن طريق الغمر في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية، ثم نقل القارورة إلى الفريزر ناقص 80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل، وتكرار هذا الإجراء لجميع الأنسجة.تجانس الأنسجة الصلبة باستخدام هاون والحشرات. قبل التجانس، قم بتبريد الهاون والحشرات والملعقة باستخدام النيتروجين السائل لمنع العينة من الذوبان. معالجة عينة واحدة فقط في كل مرة.نقل عينة الأنسجة إلى هاون باستخدام ملعقة مبردة. صب النيتروجين السائل على رأس الأنسجة. بعد أن يتبخر النيتروجين السائل ، سحق الأنسجة مع الحشرات.إضافة النيتروجين السائل مرارا وتكرارا في حين طحن الأنسجة للحصول على مسحوق الأنسجة الدقيقة. نقل مسحوق الأنسجة الدقيقة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الصغرى المبردة مسبقا عن طريق الغمر في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية. إضافة ملليلتر واحد من محلول جوانيدينيوم فينول حمض الجليد البارد إلى كل أنبوب واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 20 دقيقة.قبل تجانس الأنسجة الصلبة المختلفة ، قم بتنظيف هاون وحشرات وملعقة بدقة مع 70٪ من الإيثانول ، ثم مع إزالة التلوث من RNase ، تليها المياه المعالجة DEPC. نقع هاون، الحشرات وملعقة في الإيثانول 70٪، ثم مسح أي السائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر. تجانس الأنسجة الرخوة باستخدام متجانس الأنسجة.لتطهير المتجانس، اغسل المسبار عن طريق تشغيل أنابيب من الإيثانول 70٪ و RNase إزالة التلوث لمدة 30 ثانية لكل غسل، ثم يغسل مع المياه المعالجة DEPC، تليها إضافية 70٪ الإيثانول، كل لمدة 30 ثانية. مسح أي سائل المتبقية مع نظيفة، والأنسجة الخالية من الوبر. إضافة ملليلتر واحد من حمض guanidinium فينول حل لملصقة مسبقا، خمسة أنابيب القاع جولة ملليلتر، ونقل عينة الأنسجة في الأنبوب.ضع الأنبوب على الجليد طوال العملية وتجانس الأنسجة لمدة أقصاها خمس نبضات 32 ، أو حتى يذوب النسيج بصريا. احتضان الأنسجة المتجانسة على الجليد حتى تتم معالجة جميع عينات الأنسجة. تطهير وتنظيف المتجانس قبل معالجة عينة الأنسجة التالية.باستخدام ملقط معقم، قم بإزالة أي قطعة نسيج موجودة في أسنان المسبار. احتضان جميع الأنسجة المتجانسة على الجليد لمدة 20 دقيقة إضافية ومن ثم نقل عينة الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى مسبقا، المبردة مسبقا 1.5 ملليلتر. تمت معالجة سبعة أنسجة مفصل الركبة البشرية الفريدة التي تم الحصول عليها من مرضى هشاشة العظام في غضون أربع ساعات من الإزالة الجراحية.تم التعرف على الأنسجة بصريا وأكدتها تلطيخ النسيج H &amp؛ E. تم تصور أقسام الأنسجة الصلبة الملطخة H &amp؛ E ، الغضاريف المفصلية ، العظام تحت الوخزات والغضروف المفصلي في ست مرات التكبير والتكبير 40 مرة. وبالمثل، تم تصور أقسام H &amp؛ E الأنسجة الرخوة الملون، وسادة الدهون infrapatellar، الرباط الصليبي الأمامي، الزليلي والعضلات المائلة vastus الوسطى في ست مرات التكبير ومن ثم في 40 مرة التكبير.وأشار تقييم جودة الحمض النووي الريبي المستخرج إلى وجود عينات عالية الجودة على أساس السلامة والغلة والنقاء ، فضلا عن عينات منخفضة الجودة ، مما يشير إلى أنه على الرغم من استخدام طريقة محسنة ، فإن عوامل خارجية مثل شدة المرض قد تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي عبر أنسجة مختلفة من نفس المريض. ومن الضروري تحديد كل نوع من أنواع الأنسجة بشكل صحيح لتمكين المقارنات داخل الأنسجة وفيما بينها داخل عينات المرضى وعبرها، لا سيما بالنظر إلى عدم التجانس الكبير في أنسجة الأمراض الأولية. تتطور تقنيات التسلسل بسرعة ، وعزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة هو شرط أساسي حاسم لاستخدام هذه التقنيات لكشف الآليات الأساسية الخاصة بالأنسجة في الأمراض المعقدة والمزمنة مثل هشاشة العظام.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

الجزئي تشريح الدماغ الجرذ لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتينات من منطقة الدماغ الخاصة

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الأول : الهضم ومجموعة من الأنسجة البنكرياس

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

جمع وعزل والإثراء التي تحدث بصورة طبيعية بكتيريا Magnetotactic من البيئة

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

استخراج وتحليل الكورتيزول من الإنسان والقرد الشعر

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

إعداد النوى الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لكلا RNA واستخراج الحمض النووي

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

جمع خزعات العضلات الهيكل العظمى من المقصورة العليا من الإنسان Musculus Tibialis الأمامي للتقييم الميكانيكي

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...