Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Forfatterne takker de forsøgsdeltagere, der gjorde denne forskning mulig og dedikerer denne rapport til nye forskere inden for slidgigt.

Denne undersøgelse protokol blev godkendt og fulgte institutionelle retningslinjer, der er fastsat af Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB # 13995).
1. Patientvalg
<ol><li>Identificer patienterne blandt dem, der er planlagt til at gennemgå TKA med en ortopædkirurg.</li>
	<li>Vælg patienterne baseret på de kriterier for støtteberettigelse, der er defineret i forsøgsprotokollen. Eksempler på inklusionskriterier omfatter at være 18 år eller ældre og have en bekræ...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

Den forelagte protokol har vist sig at være en succes med at indsamle syv primære humane OA-væv til RNA-udvinding (tabel 1) og histologisk behandling (figur 4). Før indsamling af patientprøver er det nødvendigt at etablere en IRB-godkendt protokol, ideelt i samarbejde med en kirurg eller et kirurgisk team. Anvendelse af en standardiseret protokol til indsamling af prøver (f.eks. resektion fra ensartede in situ-steder) er afgørende for at maksimere eksperimen...

Knæet er den største synoviale fælles i den menneskelige krop, der omfatter tibiofemoral fælles mellem skinnebenet og lårbenet og patellofemoral fælles mellem patella og lårbenet1. Knoglerne i knæet er foret med ledbrusk og understøttes af forskellige bindevæv, herunder menisci, fedt, ledbånd og muskler, og en synovial membran indkapsler hele leddet for at skabe et synovialvæskefyldt hulrum1,2,3 ( Figur1). Et sundt knæ fungerer som en mobil hængselled, der tillader friktionsfri bevægelse i frontplan1,3. Under patologiske forhold kan bevægelse blive begrænset og smertefuld. Den mest almindelige degenerative knæledsygdom er slidgigt (OA)4. En række risikofaktorer er kendt for at prædisponere for OA udvikling, herunder ældre alder, fedme, kvindelig sex, fælles traumer, og genetik, blandt andre5,6. Der er i øjeblikket en anslået 14 millioner mennesker i USA med symptomatisk knæ OA, med forekomsten stigende på grund af stigende befolkning alder og satser for fedme7,8. Oprindeligt anses for at være en sygdom i brusk, OA er nu forstået som en sygdom i hele fælles9. Almindeligt observerede patologiske ændringer i OA omfatter ledbrusk erosion, osteophyte dannelse, subchondral knogle fortykkelse, og betændelse i synovium9,10. Da der ikke er nogen kendt kur mod OA, fokuserer behandlinger primært på symptom (f.eks. smertebehandling)11,12, og når OA er gået videre til slutstadiet, er ledudskiftningskirurgi ofte angivet13.
Fælles udskiftning operationer kan enten være delvis eller total knæ udskiftninger, med total knæ leddyr (TKA), herunder udskiftning af hele tibiofemoral artikulation og patellofemoral fælles. Fra 2020 udføres ca. 1 million TSA'er i USA hvert år14. Under TKA resects en ortopædkirurg den øverste del af tibial plateauet og de nedre lårbenskondyler (figur 2A, 2B), der skal udstyres med proteseimplantater. Nogle gange fejlfortolkes af patienter, i en TKA, kun 8-10 mm resected fra slutningen af hver knogle, som efterfølgende er udjævnet eller dukket op igen, med metal. En indspættet polyethylenforing danner lejeoverfladen (dvs. polstring) mellem de to metalimplantater. Derudover er flere bløde vævskomponenter i leddet helt eller delvist fjernet for at opnå en ordentlig fælles balance. Blandt disse væv er mediale og laterale menisci (Figur 2C), infrapatellar fedt pad (Figur 2D), forreste korsbånd (ACL; Figur 2E), synovium (Figur 2F) og vastus medialis skrå muskel (VMO; Figur 2G) 15. Selvom TKAs generelt er en succes for OA behandling, omkring 20% af patienterne rapporterer tilbagevendende smerter efter operationen16. Sammen med de høje omkostninger og relative invasivitet af proceduren, disse begrænsninger peger på behovet for yderligere forskning for at identificere alternative behandlinger for at afbøde udviklingen af OA.
At udforske sygdomsmekanismer i OA, der kan præsentere nye muligheder for terapeutisk intervention, eksperimentelle systemer, herunder celler, væv explants, og dyremodeller kan anvendes. Celler dyrkes typisk i monolag og er afledt af primære humane eller animalske væv (f.eks chondrocytter isoleret fra brusk) eller udødeliggjorte celler (f.eks ATDC517 og CHON-00118). Mens celler kan være nyttige til at manipulere eksperimentelle variabler i et kontrolleret kulturmiljø, fanger de ikke betingelserne for det naturlige led, som er kendt for at påvirke cellefænotyper19. For bedre at generobre den komplekse kaskade af kemisk, mekanisk og celle-til-celle kommunikation, der ligger til grund for OA, findes der et alternativ i primære humane eller animalske vævsprøver, hvad enten de anvendes friske eller kultiverede ex vivo som explants, for at bevare vævsstrukturen og cellemikromiljøet20. For at studere den fælles in vivoer små (f.eks. mus21) og store (f.eks. heste22) dyremodeller for OA (f.eks. gennem kirurgisk induktion, genetisk ændring eller aldring) også nyttige. Oversættelse fra disse modeller til menneskelig sygdom kan dog begrænses af anatomiske, fysiologiske og metaboliske forskelle, blandt andre23. I betragtning af fordele og ulemper ved eksperimentelle systemer maksimerer de vigtigste styrker ved at være artsspecifikke og opretholde den ekstracellulære niche, der tilbydes af det primære menneskelige OA-væv, forskningsresultaternes translationelle potentiale.
Primære humane OA væv kan let opnås efter TKA, hvilket gør den høje frekvens af TKAs en værdifuld ressource for forskning. Blandt potentielle eksperimentelle anvendelser er genekspression og histologiske analyser. At realisere potentialet i primære menneskelige OA væv for disse forskningsmetoder og andre, skitseret er følgende centrale overvejelser. For det første er brugen af patientprøver underlagt etisk regulering, og protokoller skal opfylde IRB's godkendelser (Institutional Review Board)24. For det andet skaber den iboende heterogenitet af humane primære syge væv og påvirkningen af variabler som alder og køn blandt andet behovet for omhyggelig patientvalg (dvs. anvendelse af kriterier for støtteberettigelse) og datafortolkning. For det tredje kan de unikke biologiske egenskaber ved forskellige væv i leddet (f.eks. lav cellulæritet af brusk og menisk25)give udfordringer under forsøg (f.eks. isolering af høj kvalitet og mængde RNA). Denne rapport behandler disse overvejelser og indeholder en protokol for patientvalg, prøvebehandling, vævs homogenisering, RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol (dvs. vurdering af RNA-renhed og -integritet; Figur 3) at tilskynde til brug af primære humane OA væv i forskersamfundet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

Slidgigt (OA) er en kronisk og degenerativ ledsygdom, der oftest påvirker knæet. Da der i øjeblikket ikke er nogen kur, er total knæ leddyr (TKA) et almindeligt kirurgisk indgreb. Forsøg med primære humane OA-væv fra TKA giver mulighed for at undersøge sygdomsmekanismer ex vivo. Mens OA tidligere blev anset for at påvirke primært brusk, Det er nu kendt for at påvirke flere væv i leddet. Denne protokol beskriver patientvalg, prøvebehandling, vævs homogenisering, RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol (baseret på RNA-renhed, integritet og udbytte) fra hvert af syv unikke væv til støtte for sygdomsmekanismeundersøgelse i knæleddet. Med informeret samtykke blev der udtaget prøver fra patienter, der gennemgik TKA for OA. Væv blev dissekeret, vasket, og opbevares inden for 4 timer af kirurgi ved flash frysning for RNA eller formalin fiksering for histologi. Indsamlet væv omfattede ledbrusk, subchondral knogle, menisk, infrapatellar fedt pad, forreste korsbånd, synovium, og vastus medialis skrå muskel. RNA-ekstraktionsprotokoller blev testet for hver vævstype. Den mest betydningsfulde ændring involverede den metode til opløsning, der anvendes til lavcellet, højmatrix, hårdt væv (betragtes som brusk, knogle og menisk) versus relativt højcellet, lavmatrix, blødt væv (betragtes som fedtpude, ledbånd, synovium og muskler). Det blev konstateret, at pulverisering var passende for hårdt væv, og homogenisering var passende for blødt væv. En tilbøjelighed for nogle forsøgspersoner til at give højere RNA integritet nummer (RIN) værdier end andre forsøgspersoner konsekvent på tværs af flere væv blev observeret, hvilket tyder på, at underliggende faktorer såsom sygdom sværhedsgrad kan påvirke RNA kvalitet. Evnen til at isolere RNA af høj kvalitet fra primære humane OA-væv giver en fysiologisk relevant model for sofistikerede genekspressionsforsøg, herunder sekventering, der kan føre til klinisk indsigt, der lettere oversættes til patienter.

Syv unikke menneskelige knæled væv er tilgængelige for indsamling fra patienter, der gennemgår TKA for OA (Figur 1). I denne protokol blev hvert af disse væv identificeret og behandlet inden for 4 timer efter kirurgisk fjernelse (Figur 2). Efter de trin, der er beskrevet i figur 3, blev dele af hvert væv formalin-faste til histologisk vurdering (figur 4), mens andre dele blev flash-frosne til RNA-...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Primære væv fra patienter efter total knæ leddyr giver en eksperimentel model for slidgigt forskning med maksimal klinisk oversættelsesevne. Denne protokol beskriver, hvordan man identificerer, behandler og isolerer RNA fra syv unikke knævæv for at støtte mekanistisk undersøgelse i human slidgigt.

Vævssamling og RNA-udvinding fra human osteoarthritic knee joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Denne protokol tilskynder til brug af primære humane væv som en klinisk relevant model for slidgigt forskning. Udførelse af genekspression og histologiske analyser i disse væv kan give nye mekanistiske indsigter. Denne teknik standardiserer metoder til identifikation og behandling af menneskelige knæledkomponenter.Det gør det muligt at ekstraktion af RNA af høj kvalitet, der opfylder kravene til downstream-genekspressionsanalyser. Det er udfordrende at opnå RNA af høj kvalitet fra syge ledvæv, så betydningen af tilsyneladende ubetydelige trin, såsom at holde alt rent og køligt, bør ikke undervurderes. Demonstrere proceduren vil være Thomas Wilson, en forskningsmedarbejder og Navdeep Kaur, en postdoc fra mit laboratorium.Begynd med at identificere de hårde væv, herunder brusk, knogle, og menisk og blødt væv, herunder infrapatellar fedt pad, forreste korsbånd, synovium og vastus medialis skrå muskel fra prøven baseret på forskellene i størrelse, form, farve og tekstur. Skær hvert af vævene i tre sektioner. Skyl vævssektionerne med steril PBS for at fjerne eventuelle rester eller snavs.Til RNA-ekstraktion skæres hver af de tre vævssektioner i ca. en til to millimeter terninger. Overfør de mindre stykker til en to milliliter kryo hætteglas. Efter at have sikret hætterne tæt, skal hætteglassene fryses hætteglasset ved at nedsænke flydende nitrogen i 30 sekunder, derefter overføre hætteglasset til minus 80 grader Celsius fryser til langtidsopbevaring og gentage denne procedure for alle væv.Homogeniser det hårde væv ved hjælp af en mørtel og støder. Før homogenisering afkøles mørtel, støder og spatel ved hjælp af flydende nitrogen for at forhindre prøven i at optø. Behandl kun ét eksempel ad gangen.Overfør vævsprøven til mørtel ved hjælp af en kølet spatel. Hæld flydende nitrogen oven på vævet. Når det flydende nitrogen fordamper, knuses vævet med en støder.Gentagne gange tilsættes flydende nitrogen under slibning af vævet for at opnå fint vævspulver. Overfør det fine vævspulver i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, der er forkølet ved at nedsænke flydende nitrogen i 30 sekunder. Tilsæt en milliliter af den iskolde syre guanidinium phenolopløsning til hvert rør og inkuber rørene på is i 20 minutter.Før du homogeniserer forskellige hårde væv, rengør mørtel, støder og spatel grundigt med 70% ethanol, derefter med RNase dekontaminering, efterfulgt af DEPC behandlet vand. Blød mørtel, støder og spatel i 70% ethanol, og tør derefter enhver resterende væske med et rent, fnugfrit væv. Homogeniser det bløde væv ved hjælp af vævs homogenisatoren.Til desinfektion af homogenisatoren vaskes sonden ved at køre rør med 70% ethanol og RNase dekontaminering i 30 sekunder pr. vask og vaskes derefter med DEPC-behandlet vand efterfulgt af yderligere 70% ethanol, hver i 30 sekunder. Tør eventuel resterende væske af med et rent, fnugfrit væv. Tilsæt en milliliter syre guanidinium phenolopløsning til præ-mærket, fem milliliter runde bundrør, og overfør vævsprøven i røret.Placer røret på is under hele proceduren og homogeniser vævet i højst fem 32. pulser, eller indtil vævet er visuelt opløst. Inkuber det homogeniserede væv på is, indtil alle vævsprøverne er behandlet. Desinficer og rengør homogenisatoren, inden den næste vævsprøve behandles.Brug sterile sammenkr vil du fjerne vævsklump, der er til stede i sondens tænder. Inkuber alt det homogeniserede væv på isen i yderligere 20 minutter, og overfør derefter vævsprøven til et formærket, forkølet 1,5 milliliter mikrocentrifugrør. Syv unikke menneskelige knæled væv fremstillet af slidgigt patienter blev behandlet inden for fire timer efter kirurgisk fjernelse.Vævene blev identificeret visuelt og bekræftet af H &E histologisk farvning. H &E farvede hårde væv sektioner, ledbrusk, subchondral knogle og menisk blev visualiseret på seks gange forstørrelse og 40 gange forstørrelse. Tilsvarende H &E farvede blødt væv sektioner, infrapatellar fedt pad, forreste korsbånd, synovium og vastus medialis skrå muskel blev visualiseret ved seks gange forstørrelse og derefter på 40 gange forstørrelse.Kvalitetsvurderingen af udvundet RNA indikerede tilstedeværelsen af prøver af høj kvalitet baseret på integritet, udbytte og renhed samt prøver af lav kvalitet, hvilket tyder på, at på trods af at eksterne faktorer som sygdoms sværhedsgrad kan påvirke RNA-kvaliteten på tværs af forskellige væv fra samme patient. Korrekt identifikation af hver vævstype er nødvendig for at muliggøre sammenligninger inden for og mellem væv i og på tværs af patientprøver, især i betragtning af den betydelige heterogenitet af primær sygdomsvæv. Sekventeringsteknologier udvikler sig hurtigt, og isolering af RNA af høj kvalitet er en afgørende forudsætning for at bruge disse teknologier til at optrævle underliggende vævsspecifikke mekanismer i komplekse, kroniske sygdomme som slidgigt.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Indsamling, Isolering og berigelse af naturligt forekommende Magnetotactic Bakterier fra Miljø

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Udvinding og analyse af Cortisol fra menneske og Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolation fra Mouse Pancreas: en ribonuklease-rige væv

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Fremstilling af formalin-fikseret paraffinindlejret væv borekerner til både RNA og DNA ekstraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Beriger udbyttet af humane melanocytter fra voksent hudvæv

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Indsamling af skeletmuskulatur biopsier fra superior rum humane musculus Tibialis forreste til mekanisk evaluering

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...