Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

De auteurs bedanken de studiedeelnemers die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt en dragen dit rapport op aan nieuwe wetenschappers op het gebied van artrose.

Dit onderzoeksprotocol werd goedgekeurd en volgde de institutionele richtlijnen van de Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).
1. Selectie van patiënten
<ol><li>Identificeer de patiënten uit degenen die gepland zijn om TKA te ondergaan met een orthopedisch chirurg.</li>
	<li>Selecteer de patiënten op basis van de geschiktheidscriteria die zijn gedefinieerd in het onderzoeksprotocol. Voorbeelden van inclusiecriteria zijn 18 jaar of ouder zijn en een bevestigde dia...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol is succesvol gebleken voor het verzamelen van zeven primaire menselijke OA-weefsels voorRNA-extractie( tabel 1 ) en histologische verwerking (figuur 4). Voorafgaand aan het verzamelen van patiëntmonsters, is het noodzakelijk om een IRB-goedgekeurd protocol op te stellen, idealiter in samenwerking met een chirurg of chirurgisch team. Het toepassen van een gestandaardiseerd protocol voor het verzamelen van monsters (bijv. Resectie van consistente <...

De knie is het grootste synoviale gewricht in het menselijk lichaam, bestaande uit het tibiofemorale gewricht tussen het scheenbeen en het dijbeen en het patellofemorale gewricht tussen de patella en het dijbeen1. De botten in de knie zijn bekleed met gewrichtskraakbeen en worden ondersteund door verschillende bindweefsels, waaronder menisci, vet, ligamenten en spieren, en een synoviaal membraan kapselt het hele gewricht in om een met synoviale vloeistof gevulde holte1,2,3 te creëren(figuur 1). Een gezonde knie functioneert als een mobiel scharniergewricht dat wrijvingsloze beweging in het frontale vlak1,3mogelijk maakt. Onder pathologische omstandigheden kan beweging beperkt en pijnlijk worden. De meest voorkomende degeneratieve kniegewrichtsziekte is artrose (OA)4. Van een verscheidenheid aan risicofactoren is bekend dat ze vatbaar zijn voor de ontwikkeling van artrose, waaronder oudere leeftijd, obesitas, vrouwelijk geslacht, gewrichtstrauma en genetica, onder andere5,6. Er zijn momenteel naar schatting 14 miljoen mensen in de VS met symptomatische knie artrose, waarbij de prevalentie toeneemt als gevolg van de stijgende leeftijd van de bevolking en de percentages van obesitas7,8. Aanvankelijk beschouwd als een ziekte van het kraakbeen, wordt artrose nu begrepen als een ziekte van het hele gewricht9. Vaak waargenomen pathologische veranderingen in artrose omvatten gewrichtskraakbeenerosie, osteofytvorming, subchondrale botverdikking en ontsteking van het synovium9,10. Omdat er geen bekende remedie voor artrose is, richten behandelingen zich voornamelijk op symptoom (bijv. Pijn) management11,12,en zodra artrose is gevorderd tot het eindstadium, wordt gewrichtsvervangende chirurgie vaak geïndiceerd13.
Gewrichtsvervangende operaties kunnen gedeeltelijke of totale knieprothesen zijn, met totale kniearthroplastiek (TKA) inclusief het vervangen van de gehele tibiofemorale articulatie en het patellofemorale gewricht. Vanaf 2020 worden elk jaar ongeveer 1 miljoen TKAs uitgevoerd in de VS14. Tijdens TKA rekt een orthopedisch chirurg het bovenste deel van het tibiale plateau en de onderste femorale condylen (figuur 2A, 2B) om te worden uitgerust met prothetische implantaten. Soms verkeerd geïnterpreteerd door patiënten, wordt in een TKA slechts 8-10 mm gereseceerd vanaf het uiteinde van elk bot, dat vervolgens wordt afgedekt of opnieuw wordt opgedoken, met metaal. Een tussenliggende polyethyleen voering vormt het lageroppervlak (d.w.z. vulling) tussen de twee metalen implantaten. Bovendien worden verschillende zachte weefselcomponenten van het gewricht geheel of gedeeltelijk weggesneden om een goede gezamenlijke balans te bereiken. Onder deze weefsels bevinden zich de mediale en laterale menisci (figuur 2C), infrapatellaire vetkussen (figuur 2D), voorste kruisband (ACL; Figuur 2E), synovium (figuur 2F) en vastus medialis schuine spier (VMO; Figuur 2G) 15. Hoewel TKAs over het algemeen succesvol zijn voor artrosebehandeling, meldt ongeveer 20% van de patiënten herhaling van pijn na de operatie16. Samen met de hoge kosten en relatieve invasiviteit van de procedure, wijzen deze beperkingen op de noodzaak van verder onderzoek om alternatieve behandelingen te identificeren om de progressie van artrose te verminderen.
Om ziektemechanismen in artrose te onderzoeken die nieuwe wegen voor therapeutische interventie kunnen bieden, kunnen experimentele systemen, waaronder cellen, weefselexplantaten en diermodellen worden gebruikt. Cellen worden meestal gekweekt in monolaag en zijn afgeleid van primaire menselijke of dierlijke weefsels (bijv. Chondrocyten geïsoleerd uit kraakbeen) of vereeuwigde cellen (bijv. ATDC517 en CHON-00118). Hoewel cellen nuttig kunnen zijn voor het manipuleren van experimentele variabelen in een gecontroleerde kweekomgeving, vangen ze geen omstandigheden van het natuurlijke gewricht op waarvan bekend is dat ze celfenotypenbeïnvloeden 19. Om de complexe cascade van chemische, mechanische en cel-naar-cel communicatie die ten grondslag ligt aan artrose beter samen te vatten, wordt een alternatief gevonden in primaire menselijke of dierlijke weefselmonsters, ongeacht of ze vers of ex vivo als explantaten worden gebruikt, om de weefselstructuur en de celmicro-omgeving te behouden20. Om het gewricht in vivote bestuderen, zijn kleine (bijv. muis21)en grote (bijv. paard22)diermodellen voor artrose (bijv. door chirurgische inductie, genetische verandering of veroudering) ook nuttig. De vertaling van deze modellen naar menselijke ziekten kan echter worden beperkt door anatomische, fysiologische en metabole verschillen, onder andere23. Gezien de voor- en nadelen van experimentele systemen, maximaliseren de belangrijkste sterke punten van het soortspecifiek zijn en het handhaven van de extracellulaire niche die wordt aangeboden door de primaire menselijke OA-weefsels het translationele potentieel van onderzoeksresultaten.
Primaire menselijke OA-weefsels kunnen gemakkelijk worden verkregen na TKA, waardoor de hoge frequentie van TKA's een waardevolle bron voor onderzoek is. Tot de mogelijke experimentele toepassingen behoren genexpressie en histologische analyses. Om het potentieel van primaire menselijke OA-weefsels voor deze onderzoeksbenaderingen en andere te realiseren, worden de volgende belangrijke overwegingen geschetst. Ten eerste is het gebruik van patiëntspecimens onderworpen aan ethische regelgeving en moeten protocollen voldoen aan de goedkeuringen van de Institutional Review Board (IRB)24. Ten tweede creëren de inherente heterogeniteit van menselijke primaire zieke weefsels en de invloed van variabelen zoals leeftijd en geslacht, onder andere, de behoefte aan zorgvuldige patiëntenselectie (d.w.z. toepassing van subsidiabiliteitscriteria) en gegevensinterpretatie. Ten derde kunnen de unieke biologische eigenschappen van verschillende weefsels in het gewricht (bijv. Lage cellulariteit van kraakbeen en meniscus25) uitdagingen opleveren tijdens experimenten (bijvoorbeeld het isoleren van hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA). Dit rapport behandelt deze overwegingen en presenteert een protocol voor patiëntenselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (d.w.z. beoordeling van RNA-zuiverheid en -integriteit; Figuur 3) het gebruik van primaire menselijke artroseweefsels in de onderzoeksgemeenschap aan te moedigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

Artrose (OA) is een chronische en degeneratieve gewrichtsaandoening die meestal de knie aantast. Omdat er momenteel geen genezing is, is totale knieartroplastiek (TKA) een veel voorkomende chirurgische ingreep. Experimenten met primaire menselijke OA-weefsels verkregen uit TKA bieden de mogelijkheid om ziektemechanismen ex vivote onderzoeken. Terwijl eerder werd gedacht dat artrose vooral het kraakbeen beïnvloedde, is nu bekend dat het meerdere weefsels in het gewricht beïnvloedt. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (gebaseerd op RNA-zuiverheid, integriteit en opbrengst) van elk van de zeven unieke weefsels ter ondersteuning van onderzoek naar ziektemechanismen in het kniegewricht. Met geïnformeerde toestemming werden monsters verkregen van patiënten die TKA voor artrose ondergingen. Weefsels werden ontleed, gewassen en opgeslagen binnen 4 uur na de operatie door flash freezing voor RNA of formaline fixatie voor histologie. Verzamelde weefsels omvatten gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus, infrapatellair vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier. RNA-extractieprotocollen werden getest voor elk weefseltype. De belangrijkste modificatie betrof de methode van desintegratie die wordt gebruikt voor laagcellige, hoog-matrix, harde weefsels (beschouwd als kraakbeen, bot en meniscus) versus relatief hoogcellige, lage matrix, zachte weefsels (beschouwd als vetkussen, ligament, synovium en spier). Het bleek dat verpulvering geschikt was voor harde weefsels en homogenisatie geschikt was voor zachte weefsels. Een neiging voor sommige proefpersonen om hogere RNA-integriteitsgetalwaarden (RIN) op te leveren dan andere proefpersonen consistent over meerdere weefsels, wat suggereert dat onderliggende factoren zoals de ernst van de ziekte de RNA-kwaliteit kunnen beïnvloeden. Het vermogen om hoogwaardig RNA te isoleren uit primaire menselijke OA-weefsels biedt een fysiologisch relevant model voor geavanceerde genexpressie-experimenten, inclusief sequencing, die kunnen leiden tot klinische inzichten die gemakkelijker worden vertaald naar patiënten.

Zeven unieke menselijke kniegewrichtweefsels zijn beschikbaar voor verzameling van patiënten die TKA ondergaan voor artrose(figuur 1). In dit protocol werd elk van deze weefsels geïdentificeerd en verwerkt binnen 4 uur na chirurgische verwijdering(figuur 2). Volgens de stappen in figuur 3werden delen van elk weefsel geformaliseerd voor histologische beoordeling(figuur 4),terwijl andere delen werden ge...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Primaire weefsels verkregen van patiënten na totale knieartroplastiek bieden een experimenteel model voor artroseonderzoek met maximale klinische vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft hoe RNA uit zeven unieke knieweefsels kan worden geïdentificeerd, verwerkt en geïsoleerd om mechanistisch onderzoek bij menselijke artrose te ondersteunen.

Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Dit protocol moedigt het gebruik van primaire menselijke weefsels aan als een klinisch relevant model voor artroseonderzoek. Het uitvoeren van genexpressie en histologische analyses in deze weefsels kan nieuwe mechanistische inzichten opleveren. Deze techniek standaardiseert methoden voor de identificatie en verwerking van menselijke kniegewrichtcomponenten.Het maakt de extractie van hoogwaardig RNA mogelijk dat voldoet aan de vereisten voor downstream genexpressie-assays. Het is een uitdaging om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen uit zieke gewrichtsweefsels, dus het belang van schijnbaar onbeduidende stappen, zoals alles schoon en koel houden, moet niet worden onderschat. Thomas Wilson, een onderzoeksmedewerker en Navdeep Kaur, een postdoctoraal fellow van mijn laboratorium, demonstreren de procedure.Begin met het identificeren van de harde weefsels, waaronder kraakbeen, bot en meniscus en zachte weefsels, inclusief infrapatellaire vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier van het monster op basis van de verschillen in de grootte, vorm, kleur en textuur. Snijd elk van de weefsels in drie secties. Spoel de weefselsecties af met steriel PBS om eventuele resten of vuil te verwijderen.Voor RNA-extractie snijdt u elk van de drie weefselsecties in kubussen van ongeveer één tot twee millimeter. Breng de kleinere stukjes over in een cryoflacon van twee milliliter. Nadat u de doppen stevig hebt vastgeklemd, vriest u de injectieflacons in door ze gedurende 30 seconden onder te dompelen in vloeibare stikstof, breng de injectieflacon vervolgens over naar de vriezer van min 80 graden Celsius voor langdurige opslag en herhaal deze procedure voor alle weefsels.Homogeniseer het harde weefsel met behulp van een vijzel en stamper. Koel vóór de homogenisatie de vijzel, stamper en spatel af met vloeibare stikstof om te voorkomen dat het monster ontdooit. Verwerk slechts één monster tegelijk.Breng het weefselmonster over in de mortel met behulp van een gekoelde spatel. Giet vloeibare stikstof op het weefsel. Nadat de vloeibare stikstof is verdampt, verplettert u het weefsel met een stamper.Voeg herhaaldelijk vloeibare stikstof toe tijdens het malen van het weefsel om fijn weefselpoeder te verkrijgen. Breng het fijne weefselpoeder over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, voorgekoeld door gedurende 30 seconden onder te dompelen in vloeibare stikstof. Voeg een milliliter van de ijskoude zure guanidiniumfenoloplossing toe aan elke buis en incubeer de buizen gedurende 20 minuten op ijs.Voordat u verschillende harde weefsels homogeniseert, reinigt u de vijzel, stamper en spatel grondig met 70% ethanol, vervolgens met RNase-ontsmettingsmiddel, gevolgd door DEPC-behandeld water. Week de vijzel, stamper en spatel in 70% ethanol en veeg vervolgens alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel. Homogeniseer het zachte weefsel met behulp van de weefselhomogenisator.Voor het desinfecteren van de homogenisator wast u de sonde door buizen van 70% ethanol en RNase-ontsmettingsmiddel gedurende 30 seconden per wasbeurt en vervolgens te wassen met MET DEPC behandeld water, gevolgd door nog eens 70% ethanol, elk gedurende 30 seconden. Veeg alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel. Voeg één milliliter zure guanidiniumfenoloplossing toe aan voorgelabelde, vijf milliliter ronde bodembuizen en breng het weefselmonster over in de buis.Plaats de buis gedurende de hele procedure op ijs en homogeniseer het weefsel gedurende maximaal vijf 32e pulsen, of totdat het weefsel visueel is opgelost. Incubeer het gehomogeniseerde weefsel op ijs totdat alle weefselmonsters zijn verwerkt. Desinfecteer en reinig de homogenisator voordat u het volgende weefselmonster verwerkt.Verwijder met behulp van een steriele tang alle weefselbrokken die aanwezig zijn in de tanden van de sonde. Incubeer al het gehomogeniseerde weefsel op het ijs gedurende nog eens 20 minuten en breng het weefselmonster vervolgens over naar een vooraf gelabelde, voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Zeven unieke menselijke kniegewrichtsweefsels verkregen van artrosepatiënten werden binnen vier uur na chirurgische verwijdering verwerkt.De weefsels werden visueel geïdentificeerd en bevestigd door H& E histologische kleuring. De H & E gekleurde harde weefselsecties, gewrichtskraakbeen, subchondraal bot en meniscus werden gevisualiseerd bij zes keer vergroting en 40 keer vergroting. Evenzo werden de H & E-gekleurde weke delen, infrapatellaire vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier gevisualiseerd bij zes keer vergroting en vervolgens bij 40 keer vergroting.De kwaliteitsbeoordeling van geëxtraheerd RNA wees op de aanwezigheid van hoogwaardige monsters op basis van integriteit, opbrengst en zuiverheid, evenals monsters van lage kwaliteit, wat suggereert dat ondanks het gebruik van een geoptimaliseerde methode, externe factoren zoals de ernst van de ziekte van invloed kunnen zijn op de RNA-kwaliteit in verschillende weefsels van dezelfde patiënt. Een correcte identificatie van elk weefseltype is noodzakelijk om intra- en interweefselvergelijkingen binnen en tussen patiëntmonsters mogelijk te maken, vooral gezien de aanzienlijke heterogeniteit van primaire ziekteweefsels. Sequencingtechnologieën evolueren snel en isolatie van hoogwaardig RNA is een cruciale voorwaarde voor het gebruik van deze technologieën om onderliggende weefselspecifieke mechanismen bij complexe, chronische ziekten zoals artrose te ontrafelen.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissectie van hersenen van de rat voor RNA of eiwit-extractie uit specifieke hersengebieden regio

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

RNA-extractie uit Neuroprecursor cellen met behulp van de Bio-Rad Totaal RNA Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Collection, Isolatie en Verrijking van natuurlijk voorkomende Magnetotactic Bacteriën van het milieu

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extractie en analyse van Cortisol van de mens en de Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Verzameling skeletspierbiopten uit het superieure compartiment van human musculus Tibialis Anterior voor mechanische evaluatie

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...