Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Les auteurs remercient les participants à l’étude qui ont rendu cette recherche possible et dévouent ce rapport à de nouveaux scientifiques dans le domaine de l’arthrose.

Ce protocole d’étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices institutionnelles établies par le Henry Ford Health System Institutional Review Board (CISR no 13995).
1. Sélection des patients
<ol><li>Identifiez les patients parmi ceux qui doivent subir une ATK avec un chirurgien orthopédiste.</li>
	<li>Sélectionnez les patients en fonction des critères d’éligibilité définis par le protocole de l’étude. Des exemples de critères d’inclusion comprennent le fait d’...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

Le protocole présenté s’est avéré efficace pour la collecte de sept tissus humains primaires d’arthrose pour l’extraction de l’ARN (Tableau 1) et le traitement histologique (Figure 4). Avant de prélever des échantillons de patients, il est nécessaire d’établir un protocole approuvé par la CISR, idéalement en collaboration avec un chirurgien ou une équipe chirurgicale. L’application d’un protocole normalisé pour le prélèvement d’échantillons (p....

Le genou est la plus grande articulation synoviale du corps humain, comprenant l’articulation tibofemorale entre le tibia et le fémur et l’articulation fémoro-patellaire entre la rotule et le fémur1. Les os du genou sont tapissés de cartilage articulaire et soutenus par divers tissus conjonctifs, y compris les méniques, la graisse, les ligaments et les muscles, et une membrane synoviale encapsule toute l’articulation pour créer une cavité remplie de liquide synovial1,2,3 ( Figure1). Un genou sain fonctionne comme une articulation de charnière mobile qui permet un mouvement sans friction dans le plan frontal1,3. Dans des conditions pathologiques, les mouvements peuvent devenir restreints et douloureux. La maladie dégénérative de l’articulation du genou la plus courante est l’arthrose (OA)4. Une variété de facteurs de risque sont connus pour prédisposer au développement de l’arthrose, y compris l’âge avancé, l’obésité, le sexe féminin, les traumatismes articulaires et la génétique, entre autres5,6. On estime actuellement à 14 millions le nombre de personnes atteintes d’arthrose symptomatique du genou aux États-Unis, la prévalence augmentant en raison de l’augmentation de l’âge de la population et des taux d’obésité7,8. Initialement considérée comme une maladie du cartilage, l’arthrose est maintenant comprise comme une maladie de l’ensemble de l’articulation9. Les changements pathologiques couramment observés dans l’arthrose comprennent l’érosion du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, l’épaississement osseux sous-chondral et l’inflammation de la synoviale9,10. Comme il n’existe pas de remède connu pour l’arthrose, les traitements se concentrent principalement sur la gestion des symptômes (par exemple, la douleur)11,12, et une fois que l’arthrose a progressé au stade final, la chirurgie de remplacement articulaire est souvent indiquée13.
Les chirurgies de remplacement articulaire peuvent être des arthroplasties partielles ou totales du genou, avec une arthroplastie totale du genou (TKA), y compris le remplacement de toute l’articulation tibofémorale et de l’articulation fémoro-patellaire. En 2020, environ 1 million de TKA sont effectuées aux États-Unis chaque année14. Au cours de l’ATK, un chirurgien orthopédiste réséque la partie supérieure du plateau tibial et les condyles fémoraux inférieurs(Figure 2A,2B)à équiper d’implants prothétiques. Parfois mal interprété par les patients, dans un TKA, seulement 8-10 mm sont réséqués à partir de l’extrémité de chaque os, qui est ensuite coiffé ou resurfacé, avec du métal. Une doublure en polyéthylène interposée forme la surface de roulement (c.-à-d. le rembourrage) entre les deux implants métalliques. En outre, plusieurs composants des tissus mous de l’articulation sont entièrement ou partiellement excisés pour atteindre un bon équilibre articulaire. Parmi ces tissus figurent les ménesques médiaux et latéraux(Figure 2C),le coussinet adipeux infrapellaire(Figure 2D),le ligament croisé antérieur (LCA; Figure 2E), synoviale (Figure 2F) et muscle oblique vastus medialis (VMO; Figure 2G) 15. Bien que les ENTK réussissent généralement pour le traitement de l’arthrose, environ 20% des patients signalent une réapparition de la douleur après la chirurgie16. En plus du coût élevé et du caractère relativement invasif de la procédure, ces limites soulignent la nécessité de recherches supplémentaires pour identifier d’autres traitements afin d’atténuer la progression de l’arthrose.
Pour explorer les mécanismes pathologiques de l’arthrose qui peuvent présenter de nouvelles voies d’intervention thérapeutique, des systèmes expérimentaux, y compris des cellules, des explants tissulaires et des modèles animaux, peuvent être utilisés. Les cellules sont généralement cultivées en monocouche et sont dérivées de tissus humains ou animaux primaires (par exemple, des chondrocytes isolés du cartilage) ou de cellules immortalisées (par exemple, ATDC517 et CHON-00118). Bien que les cellules puissent être utiles pour manipuler des variables expérimentales dans un environnement de culture contrôlée, elles ne capturent pas les conditions de l’articulation naturelle qui sont connues pour avoir un impact sur les phénotypes cellulaires19. Pour mieux récapituler la cascade complexe de communication chimique, mécanique et cellulaire à cellule sous-jacente à l’arthrose, une alternative est trouvée dans les échantillons de tissus humains ou animaux primaires, qu’ils soient utilisés frais ou cultivés ex vivo comme explants, pour préserver la structure tissulaire et le microenvironnement cellulaire20. Afin d’étudier l’articulation in vivo,de petits modèles animaux (p. ex., souris21) et grands (p. ex., cheval22)pour l’arthrose (p. ex., induction chirurgicale, altération génétique ou vieillissement) sont également utiles. Cependant, la traduction de ces modèles à la maladie humaine peut être limitée par des différences anatomiques, physiologiques et métaboliques, entre autres23. Compte tenu des avantages et des inconvénients des systèmes expérimentaux, les principaux atouts d’être spécifiques à l’espèce et de maintenir la niche extracellulaire offerte par les principaux tissus humains d’arthrose maximisent le potentiel translationnel des résultats de la recherche.
Les tissus humains primaires d’arthrose peuvent être facilement obtenus après l’ATK, ce qui fait de la fréquence élevée des ATK une ressource précieuse pour la recherche. Parmi les applications expérimentales potentielles figurent l’expression génique et les analyses histologiques. Pour réaliser le potentiel des tissus humains primaires d’arthrose pour ces approches de recherche et d’autres, les considérations clés suivantes sont décrites. Premièrement, l’utilisation d’échantillons de patients est assujettie à une réglementation éthique, et les protocoles doivent être conformes aux approbations de la Commission d’examen institutionnel(CISR) 24. Deuxièmement, l’hétérogénéité inhérente des tissus humains primaires malades et l’influence de variables telles que l’âge et le sexe, entre autres, créent la nécessité d’une sélection minutieuse des patients (c.-à-d. l’application de critères d’admissibilité) et d’une interprétation des données. Troisièmement, les propriétés biologiques uniques de différents tissus de l’articulation (p. ex., faible cellularité du cartilage et du ménisque25)peuvent présenter des défis lors d’expériences (p. ex., isoler une qualité et une quantité élevées d’ARN). Le présent rapport aborde ces considérations et présente un protocole pour la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (c.-à-d. évaluation de la pureté et de l’intégrité de l’ARN; Graphique 3) encourager l’utilisation de tissus humains primaires d’arthrose dans le milieu de la recherche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire chronique et dégénérative qui affecte le plus souvent le genou. Comme il n’existe actuellement aucun remède, l’arthroplastie totale du genou (ATK) est une intervention chirurgicale courante. Des expériences utilisant des tissus d’arthrose humaine primaires obtenus à partir de TKA fournissent la capacité d’étudier les mécanismes de la maladie ex vivo. Alors que l’arthrose était auparavant considérée comme ayant un impact principalement sur le cartilage, on sait maintenant qu’elle affecte plusieurs tissus de l’articulation. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (basé sur la pureté, l’intégrité et le rendement de l’ARN) de chacun des sept tissus uniques pour soutenir l’investigation du mécanisme de la maladie dans l’articulation du genou. Avec le consentement éclairé, des échantillons ont été prélevés sur des patients souffrant d’ATK pour l’arthrose. Les tissus ont été disséqués, lavés et stockés dans les 4 heures qui ont suivi la chirurgie par congélation éclair pour la fixation de l’ARN ou du form formel pour l’histologie. Les tissus prélevés comprenaient le cartilage articulaire, l’os sous-chondral, le ménisque, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis. Des protocoles d’extraction d’ARN ont été testés pour chaque type de tissu. La modification la plus importante concernait la méthode de désintégration utilisée pour les tissus durs à cellules basses et à matrice élevée (considérés comme cartilage, os et ménisque) par rapport aux tissus mous à cellules relativement hautes et à matrice basse (considérés comme coussinet adipeux, ligament, synoviale et muscle). Il a été constaté que la pulvérisation était appropriée pour les tissus durs et que l’homogénéisation était appropriée pour les tissus mous. Une propension de certains sujets à produire des valeurs de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) plus élevées que d’autres sujets de manière cohérente dans plusieurs tissus a été observée, suggérant que des facteurs sous-jacents tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN. La capacité d’isoler de l’ARN de haute qualité à partir de tissus humains primaires d’arthrose fournit un modèle physiologiquement pertinent pour des expériences sophistiquées d’expression génique, y compris le séquençage, qui peuvent conduire à des connaissances cliniques qui sont plus facilement traduites pour les patients.

Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain sont disponibles pour la collecte de patients souffrant d’ATK pour l’arthrose (Figure 1). Dans ce protocole, chacun de ces tissus a été identifié et traité dans les 4 heures suivant l’ablation chirurgicale (Figure 2). En suivant les étapes décrites à la figure 3,des parties de chaque tissu ont été fixées au for formel pour l’évaluation histologique (<strong c...

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Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Les tissus primaires obtenus chez les patients après une arthroplastie totale du genou fournissent un modèle expérimental pour la recherche sur l’arthrose avec une translatabilité clinique maximale. Ce protocole décrit comment identifier, traiter et isoler l’ARN de sept tissus uniques du genou pour soutenir la recherche mécaniste dans l’arthrose humaine.

Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Ce protocole encourage l’utilisation de tissus humains primaires comme modèle cliniquement pertinent pour la recherche sur l’arthrose. La réalisation d’analyses géniques et histologiques dans ces tissus peut fournir de nouvelles informations mécanistes. Cette technique normalise les méthodes d’identification et de traitement des composants de l’articulation du genou humain.Il permet l’extraction d’ARN de haute qualité qui répond aux exigences des tests d’expression génique en aval. Il est difficile d’obtenir de l’ARN de haute qualité à partir de tissus articulaires malades, de sorte que l’importance d’étapes apparemment insignifiantes, telles que garder tout propre et frais ne doit pas être sous-estimée. Thomas Wilson, associé de recherche, et Navdeep Kaur, boursier postdoctoral de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Commencez par identifier les tissus durs, y compris le cartilage, les os, le ménisque et les tissus mous, y compris le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis à partir de l’échantillon en fonction des différences de taille, de forme, de couleur et de texture. Coupez chacun des tissus en trois sections. Rincez les coupes de tissus avec du PBS stérile pour éliminer tout résidu ou débris.Pour l’extraction de l’ARN, coupez chacune des trois sections de tissu en cubes d’environ un à deux millimètres. Transférer les plus petits morceaux dans un flacon cryogénique de deux millilitres. Après avoir bien sécurisé les bouchons, congelez les flacons en les immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 secondes, puis transférez le flacon au congélateur à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme et répétez cette procédure pour tous les tissus.Homogénéiser les tissus durs à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Avant l’homogénéisation, refroidir le mortier, le pilon et la spatule à l’aide d’azote liquide pour éviter que l’échantillon ne décongele. Traiter un seul échantillon à la fois.Transférer l’échantillon de tissu dans le mortier à l’aide d’une spatule réfrigérée. Versez de l’azote liquide sur le tissu. Une fois que l’azote liquide s’est évaporé, écrasez le tissu avec un pilon.Ajoutez à plusieurs reprises de l’azote liquide tout en broyant le tissu pour obtenir de la poudre de tissu fine. Transférer la poudre de tissu fin dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pré-refroidi en immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 secondes. Ajouter un millilitre de la solution de guanidinium phénol acide glacée à chaque tube et incuber les tubes sur de la glace pendant 20 minutes.Avant d’homogénéiser différents tissus durs, nettoyez soigneusement le mortier, le pilon et la spatule avec de l’éthanol à 70%, puis avec du décontaminant RNase, suivi d’eau traitée au DEPC. Faire tremper le mortier, le pilon et la spatule dans de l’éthanol à 70%, puis essuyer tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux. Homogénéiser les tissus mous à l’aide de l’homogénéisateur tissulaire.Pour désinfecter l’homogénéisateur, laver la sonde en faisant couler des tubes d’éthanol à 70 % et de décontaminant RNase pendant 30 secondes par lavage, puis laver à l’eau traitée au DEPC, suivie d’un supplément de 70 % d’éthanol, chacun pendant 30 secondes. Essuyez tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux. Ajouter un millilitre de solution acide de guanidinium phénol dans des tubes à fond rond pré-marqués de cinq millilitres et transférer l’échantillon de tissu dans le tube.Placez le tube sur de la glace tout au long de la procédure et homogénéisez le tissu pour un maximum de cinq 32e impulsions, ou jusqu’à ce que le tissu soit dissous visuellement. Incuber le tissu homogénéisé sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons de tissus soient traités. Désinfectez et nettoyez l’homogénéisateur avant de traiter le prochain échantillon de tissu.À l’aide d’une pince stérile, retirez tout morceau de tissu présent dans les dents de la sonde. Incuber tout le tissu homogénéisé sur la glace pendant 20 minutes supplémentaires, puis transférer l’échantillon de tissu dans un tube de microcentrifugation pré-marqué et pré-réfrigéré de 1,5 millilitre. Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain obtenus à partir de patients souffrant d’arthrose ont été traités dans les quatre heures suivant l’ablation chirurgicale.Les tissus ont été identifiés visuellement et confirmés par coloration histologique H&E. Les sections de tissus durs colorées H & E, le cartilage articulaire, l’os sous-chondral et le ménisque ont été visualisés à un grossissement de six fois et à un grossissement de 40 fois. De même, les sections de tissus mous colorées H & E, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, le muscle oblique synovial et vastus medialis ont été visualisés à un grossissement de six fois, puis à un grossissement de 40 fois.L’évaluation de la qualité de l’ARN extrait a indiqué la présence d’échantillons de haute qualité basés sur l’intégrité, le rendement et la pureté, ainsi que d’échantillons de faible qualité, suggérant que malgré l’utilisation d’une méthode optimisée, des facteurs externes tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN dans différents tissus du même patient. L’identification correcte de chaque type de tissu est nécessaire pour permettre des comparaisons intra-tissulaires et inter-tissus à l’intérieur et entre les échantillons de patients, en particulier compte tenu de l’hétérogénéité considérable des tissus primaires de la maladie. Les technologies de séquençage évoluent rapidement, et l’isolement d’un ARN de haute qualité est une condition préalable essentielle à l’utilisation de ces technologies pour démêler les mécanismes tissulaires sous-jacents spécifiques dans des maladies chroniques complexes comme l’arthrose.

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