Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

המחברים מודים למשתתפי המחקר שאפשרו את המחקר ומקדישים את הדו"ח הזה למדענים חדשים בתחום דלקת מפרקים ניוונית.

פרוטוקול מחקר זה אושר ופעל על פי הנחיות מוסדיות שנקבעו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של מערכת הבריאות הנרי פורד (IRB #13995).
1. בחירת מטופל
<ol><li>זהה את המטופלים מקרב אלה המתוכננים לעבור TKA עם מנתח אורטופדי.</li>
	<li>בחר את המטופלים על סמך קריטריוני הזכאות שהוגדרו על ידי פרוטוקול המחקר. ?...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

הפרוטוקול שהוצג הוכח כמוצלח לאיסוף שבע רקמות OA אנושיות עיקריות להפקת RNA (טבלה 1) ועיבוד היסתולוגי (איור 4). לפני איסוף דגימות המטופל, יש צורך להקים פרוטוקול שאושר על ידי IRB, באופן אידיאלי בשיתוף פעולה עם מנתח או צוות כירורגי. החלת פרוטוקול מתוקנן עבור אוסף דגימות (לדו?...

הברך היא המפרק הסינוביאלי הגדול ביותר בגוף האדם, הכולל את מפרק הטיביו-דימורל בין השוקה לירך ומפרק הפטלו-מורל בין פיקת הברך לירך1. העצמות בברך מרופדים בסחוס מפרקי ונתמכות על ידי רקמות חיבור שונות, כולל מנישי, שומן, רצועות ושרירים, וממברנה סינוביאלית מתמצתת את כל המפרק כדי ליצור חלל מלא נוזלים סינוביאלי1,2,3 ( איור1). ברך בריאה מתפקדת כמפרק ציר נייד המאפשר תנועה ללא חיכוך במישור הקדמי1,3. בתנאים פתולוגיים, התנועה יכולה להיות מוגבלת וכואבת. מחלת מפרק הברך הניוונית הנפוצה ביותר היא דלקת מפרקים ניוונית (OA)4. מגוון גורמי סיכון ידועים נטייה להתפתחות OA, כולל גיל מבוגר יותר, השמנת יתר, מין נשי, טראומה משותפת, וגנטיקה, בין היתר5,6. ישנם כיום כ -14 מיליון אנשים בארה"ב עם OA ברך סימפטומטי, עם השכיחות גדלה עקב עלייה בגיל האוכלוסייה ושיעורי השמנת יתר7,8. בתחילה נחשב למחלה של הסחוס, OA הוא עכשיו הבין כמחלה של המפרק כולו9. שינויים פתולוגיים שנצפו בדרך כלל ב- OA כוללים שחיקת סחוס מפרקי, היווצרות אוסטאופית, עיבוי עצם תת-ביתית ודלקת של הסינוביום9,10. מאז אין תרופה ידועה עבור OA, טיפולים מתמקדים בעיקר סימפטום (למשל, כאב) ניהול11,12, ולאחר OA התקדם לשלב הסופי, ניתוח החלפת מפרקים הוא ציין לעתים קרובות13.
ניתוחי החלפת מפרקים יכולים להיות חלקיים או כוללים של החלפת ברך, עם ארתרופלסטיקה כוללת בברך (TKA) כולל החלפת כל הניסוח הטיביו-מורלי והמפרק הפטלו-מורלי. נכון לשנת 2020, כמיליון TKAs מבוצעים בארה"ב מדי שנה14. במהלך TKA, מנתח אורטופדי חוצה את החלק העליון של רמת הטיבי ואת חמצת הירך התחתונה (איור 2A, 2B) כדי להיות מצויד בשתלים תותבים. לפעמים לא לפרש על ידי חולים, ב TKA, רק 8-10 מ"מ נפלט מקצה כל עצם, אשר לאחר מכן כתרים או צף מחדש, עם מתכת. אניה פוליאתילנית משולבת יוצרת את משטח הנושא (כלומר, ריפוד) בין שני שתלי המתכת. בנוסף, מספר רכיבי רקמות רכות של המפרק הם excised באופן מלא או חלקי כדי להשיג איזון משותף נכון. בין הרקמות הללו ניתן למנות המנישי המהודל והקטנוני (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלרית (איור 2D), רצועה צולבת חיצונית (ACL; איור 2E, סינוביום (איור 2F) ושריר האלמוני של vastus medialis (VMO; איור 2G) 15.למרות TKAs הם בדרך כלל מוצלחים לטיפול OA, סביב 20% מהחולים מדווחים על reoccurrence של כאב לאחר הניתוח16. יחד עם העלות הגבוהה והפולשניות היחסית של ההליך, מגבלות אלה מצביעות על הצורך במחקר נוסף כדי לזהות טיפולים חלופיים כדי למתן את התקדמות OA.
כדי לחקור מנגנוני מחלה ב- OA שעשויים להציג אפיקים חדשים להתערבות טיפולית, ניתן להשתמש במערכות ניסיוניות, כולל תאים, מגרשי רקמות ומודלים של בעלי חיים. תאים הם בדרך כלל מתורבתים monolayer נגזרים רקמות האדם או בעלי החיים העיקריים (למשל, chondrocytes מבודד סחוס) או תאים מונצחים (למשל, ATDC517 ו- CHON-00118). בעוד תאים יכולים להיות שימושיים למניפולציה משתנים ניסיוניים בסביבת תרבות מבוקרת, הם אינם ללכוד את התנאים של המפרק הטבעי אשר ידועים להשפיע פנוטיפים התא19. כדי לשחזר טוב יותר את המפל המורכב של תקשורת כימית, מכנית ותא לתא שבבסיס OA, חלופה נמצאת בדגימות ראשוניות של רקמת אדם או בעלי חיים, בין אם נעשה שימוש ב- ex vivo טרי או מתורבת כאקספלנטים, כדי לשמר את מבנה הרקמות ואת microenvironment התא20. על מנת ללמוד את המפרק ב vivo, קטן (למשל, עכבר21)וגדול (למשל, סוס22) מודלים בעלי חיים עבור OA (למשל, באמצעות אינדוקציה כירורגית, שינוי גנטי, או הזדקנות) הם גם שימושיים. עם זאת, תרגום מודלים אלה למחלות אנושיות יכול להיות מוגבל על ידי הבדלים אנטומיים, פיזיולוגיים ומטבוליים, בין היתר23. בהתחשב ביתרונות ובחסרונות של מערכות ניסיוניות, נקודות החוזק העיקריות של היותן ספציפיות למינים ושמירה על הנישה החוץ-תאית המוצעת על ידי רקמות OA האנושיות העיקריות ממקסמות את הפוטנציאל התרגומי של ממצאי המחקר.
רקמות OA אנושיות ראשוניות ניתן להשיג בקלות בעקבות TKA, מה שהופך את התדירות הגבוהה של TKAs משאב בעל ערך למחקר. בין היישומים הניסיוניים הפוטנציאליים הם ביטוי גנים וניתוחים היסתולוגיים. כדי לממש את הפוטנציאל של רקמות OA אנושיות ראשוניות עבור גישות מחקר אלה ואחרים, המתוארים הם השיקולים העיקריים הבאים. ראשית, השימוש בדגימות מטופלים כפוף לרגולציה אתית, והפרוטוקולים חייבים לעמוד באישורי ועדת הביקורת המוסדית (IRB)24. שנית, ההטרוגניות הטבועה של רקמות החולים העיקריות האנושיות והשפעת משתנים כגון גיל ומין, בין היתר, יוצרות את הצורך בבחירת מטופלים זהירה (כלומר, יישום קריטריוני זכאות) ופרשנות נתונים. שלישית, התכונות הביולוגיות הייחודיות של רקמות שונות במפרק (למשל, תאיות נמוכה של סחוס ומניסקוס25) יכולות להציג אתגרים במהלך ניסויים (למשל, בידוד איכות גבוהה וכמות של RNA). דוח זה מתייחס לשיקולים אלה ומציג פרוטוקול לבחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (כלומר, הערכת טוהר ושלמות ה-RNA; איור 3) כדי לעודד את השימוש ברקמות OA האנושיות העיקריות בקהילת המחקר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית וניוונית המשפיעה לרוב על הברך. מכיוון שאין כרגע תרופה, ארתרופלסטיקה מוחלטת בברך (TKA) היא התערבות כירורגית נפוצה. ניסויים באמצעות רקמות OA אנושיות ראשוניות המתקבלות מ- TKA מספקים את היכולת לחקור מנגנוני מחלה ex vivo. בעוד OA נחשב בעבר להשפיע בעיקר על הסחוס, זה ידוע עכשיו להשפיע על רקמות מרובות במפרק. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (המבוססת על טוהר RNA, שלמות ותשואה) מכל אחת משבע רקמות ייחודיות לתמיכה בחקירת מנגנון המחלה במפרק הברך. בהסכמה מדעת, התקבלו דגימות מחולים שעברו TKA עבור OA. רקמות נותחו, נשטפו ואוחסנו תוך 4 שעות מהניתוח על ידי הקפאת הבזק עבור RNA או קיבעון פורמלין להצטולוגיה. רקמות שנאספו כללו סחוס מפרקי, עצם תת-כונדרלית, מניסקוס, כרית שומן אינפר-פטלר, רצועה צולבת, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis. פרוטוקולי מיצוי RNA נבדקו עבור כל סוג רקמה. השינוי המשמעותי ביותר כלל את שיטת ההתפוררות המשמשת לרקמות קשות בעלות תאים נמוכים, גבוהים, (הנחשבים לסחוס, עצם ומניסקוס) לעומת תאים גבוהים יחסית, מטריצה נמוכה, רקמות רכות (נחשבות כרית שומן, רצועה, סינוביום ושרירים). נמצא כי ריכוך היה מתאים לרקמות קשות, והומוגניזציה מתאימה לרקמות רכות. נצפתה נטייה של נבדקים מסוימים להניב ערכי שלמות RNA גבוהים יותר (RIN) מאשר נבדקים אחרים באופן עקבי על פני רקמות מרובות, דבר המצביע על כך שגורמים הבסיסיים כגון חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA. היכולת לבודד RNA באיכות גבוהה מרקמות OA אנושיות ראשוניות מספקת מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסויי ביטוי גנים מתוחכמים, כולל רצף, שיכול להוביל לתובנות קליניות שתורגמו בקלות רבה יותר לחולים.

שבע רקמות ייחודיות למפרק הברך האנושי זמינות לאיסוף מחולים העוברים TKA עבור OA (איור 1). בפרוטוקול זה, כל אחת מהרקמות הללו זוהתה ועובדה תוך 4 שעות מהסרה כירורגית (איור 2). בעקבות הצעדים המתוארים באיור 3,חלקים מכל רקמה תוקנו פורמרין להערכה היסתולוג?...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

רקמות ראשוניות המתקבלות מחולים בעקבות ארתרופלסטיקה כוללת בברך מספקות מודל ניסיוני למחקר דלקת מפרקים ניוונית עם תרגום קליני מקסימלי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לזהות, לעבד ולבודד RNA משבע רקמות ברכיים ייחודיות כדי לתמוך בחקירה מכנית בדלקת מפרקים ניוונית אנושית.

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

פרוטוקול זה מעודד את השימוש ברקמות אנושיות ראשוניות כמודל רלוונטי קלינית לחקר דלקת מפרקים ניוונית. ביצוע ביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים ברקמות אלה עשוי לספק תובנות מכניות חדשניות. טכניקה זו לתקנן שיטות לזיהוי ועיבוד של רכיבי מפרק הברך האנושיים.זה מאפשר הפקת RNA באיכות גבוהה העונה על הדרישות לבדיקות ביטוי גנים במורד הזרם. זה מאתגר להשיג RNA באיכות גבוהה מרקמות מפרקים חולים, ולכן אין לזלזל בחשיבות של צעדים חסרי משמעות לכאורה, כגון שמירה על הכל נקי וקריר. שידגים את ההליך יהיו תומאס וילסון, עמית מחקר ונבדיפ קור, פוסט דוקטורנט מהמעבדה שלי.התחל בזיהוי הרקמות הקשות, כולל סחוס, עצם ומניסקוס ורקמות רכות, כולל כרית שומן אינפרא-פטלר, רצועה צולבת מקדימה, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis מהדגימה בהתבסס על ההבדלים בגודל, צורה, צבע ומרקם. חותכים כל אחת מהרקמות לשלושה חלקים. יש לשטוף את מקטעי הרקמות ב-PBS סטרילי כדי להסיר שאריות או פסולת.להפקת RNA, חותכים כל אחד משלושת מקטעי הרקמה לקוביות מילימטר אחד עד שני מילימטר. מעבירים את החלקים הקטנים יותר ל-2 מיליליטר. לאחר אבטחת המכסים בחוזקה, פלאש להקפיא את הבקבוקונים על ידי שקוע בחנקן נוזלי במשך 30 שניות, ולאחר מכן להעביר את הבקבוקון למינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא לאחסון לטווח ארוך, ולחזור על הליך זה עבור כל הרקמות.הומוגניזציה של הרקמה הקשה באמצעות מרגמה ועלי. לפני הומוגניזציה, לצנן את המרגמה, עלה ומרית באמצעות חנקן נוזלי כדי למנוע את המדגם מהפשרה. עבד רק מדגם אחד בכל פעם.מעבירים את דגימת הרקמה למרגמה באמצעות מרית צוננת. יוצקים חנקן נוזלי על גבי הרקמה. לאחר החנקן הנוזלי מתאדה, למחוץ את הרקמה עם עלה.מוסיפים שוב ושוב חנקן נוזלי תוך שחיקה של הרקמה כדי להשיג אבקת רקמות עדינה. מעבירים את אבקת הרקמה העדינה בצינור צנטריפוגה זעיר 1.5 מיליליטר מקורר מראש על ידי שקוע בחנקן נוזלי במשך 30 שניות. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פנול חומצה קרה כקרח לכל צינור ודגרה הצינורות על קרח במשך 20 דקות.לפני הומוגניזציה של רקמות קשות שונות, לנקות ביסודיות את המרגמה, העלי והמריבית עם 70%אתנול, ולאחר מכן עם מחטא RNase, ואחריו DEPC מטופלים מים. השרו את המרגמה, העלי והמרית ב-70%, ואז מחקו כל נוזל שיורית עם רקמה נקייה וניתנת מוך. הומוגניזציה הרקמה הרכה באמצעות הומוגניזר הרקמה.לחיטוי homogenizer, לשטוף את הבדיקה על ידי צינורות פועלים של 70%אתנול ו RNase decontaminant במשך 30 שניות לכל לשטוף, ולאחר מכן לשטוף עם DEPC טיפול במים, ואחריו 70% אתנול נוסף, כל אחד במשך 30 שניות. יש לנגב כל שאריות נוזל עם רקמה נקייה וניתנת מוך. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פנול חומצה guanidinium לתווית מראש, חמישה מיליליטר צינורות תחתון עגולים, ולהעביר את דגימת הרקמה לתוך הצינור.מניחים את הצינור על קרח לאורך כל ההליך ומעבירים הומוגניות לרקמה למשך חמישה פולסים 32 לכל היותר, או עד שהרקמה מתמוססת חזותית. לדגור את הרקמה הומוגנית על קרח עד שכל דגימות הרקמה מעובדות. לחטא ולנקות את homogenizer לפני עיבוד דגימת הרקמה הבאה.באמצעות מלקחיים סטריליים, להסיר כל גוש רקמה נוכח בשיני הבדיקה. לדגור את כל הרקמה הומוגנית על הקרח במשך 20 דקות נוספות ולאחר מכן להעביר את דגימת הרקמה לצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש, מקורר מראש. שבע רקמות מפרקי ברך אנושיות ייחודיות שהתקבלו מחולי דלקת מפרקים ניוונית עובדו תוך ארבע שעות מהסרה כירורגית.הרקמות זוהו חזותית ואושרו על ידי כתמים היסתולוגיים H&E. קטעי הרקמות הקשות המוכתמות ב- H&E, הסחוס המפרקי, העצם התת-לימודית והמניסקוס הוצגו בהגדלה כפולה ובהגדלה של פי 40. באופן דומה, קטעי רקמות רכות מוכתמים H&E, כרית שומן infrapatellar, רצועה צולבת חיצונית, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis היו דמיינו בהגדלה של פי שישה ולאחר מכן בהגדלה של פי 40.הערכת האיכות של RNA שחולץ הצביעה על נוכחות של דגימות באיכות גבוהה המבוססות על שלמות, תשואה וטוהר, כמו גם דגימות באיכות נמוכה, מה שמרמז כי למרות שימוש בשיטה אופטימלית, גורמים חיצוניים כמו חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA על פני רקמות שונות מאותו חולה. זיהוי נכון של כל סוג רקמה יש צורך לאפשר השוואות פנים-רקמות בתוך ומרחב דגימות המטופל, במיוחד בהתחשב ההטרוגניות ניכרת של רקמות המחלה העיקרית. טכנולוגיות ריצוף מתפתחות במהירות, ובידוד של RNA באיכות גבוהה הוא תנאי מוקדם קריטי לשימוש בטכנולוגיות אלה כדי לפענח מנגנונים ספציפיים לרקמות במחלות מורכבות וכרוניות כמו דלקת מפרקים ניוונית.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-דיסקציה של מוח החולדה עבור הפקת RNA או חלבון מן אזור מסוים במוח

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

אוסף של ביופסיות שריר השלד מהתאי העליון של השרירים האנושיים Tibialis הקדמי להערכה מכנית

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...