Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Gli autori ringraziano i partecipanti allo studio che hanno reso possibile questa ricerca e dedicano questo rapporto a nuovi scienziati nel campo dell'osteoartrite.

Questo protocollo di studio è stato approvato e ha seguito le linee guida istituzionali stabilite dall'Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).
1. Selezione del paziente
<ol><li>Identificare i pazienti tra quelli programmati per sottoporsi a TKA con un chirurgo ortopedico.</li>
	<li>Selezionare i pazienti in base ai criteri di ammissibilità definiti dal protocollo di studio. Esempi di criteri di inclusione includono avere almeno 18 anni di età e avere una diagnosi...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

Il protocollo presentato si è dimostrato efficace per la raccolta di sette tessuti OA umani primari per l'estrazione dell'RNA (Tabella 1) e l'elaborazione istologica (Figura 4). Prima di raccogliere i campioni dei pazienti, è necessario stabilire un protocollo approvato dall'IRB, idealmente in collaborazione con un chirurgo o un team chirurgico. L'applicazione di un protocollo standardizzato per la raccolta dei campioni (ad esempio, la resezione da posizioni coerenti i...

Il ginocchio è la più grande articolazione sinoviale del corpo umano, comprendente l'articolazione tibiofemorale tra la tibia e il femore e l'articolazione femoro-rotula tra la rotula e il femore1. Le ossa del ginocchio sono rivestite con cartilagine articolare e supportate da vari tessuti connettivi, tra cui menischi, grasso, legamenti e muscoli, e una membrana sinoviale incapsula l'intera articolazione per creare una cavità piena di liquido sinoviale1,2,3 ( Figura1). Un ginocchio sano funziona come un'articolazione a cerniera mobile che consente un movimento senza attrito nel piano frontale1,3. In condizioni patologiche, il movimento può diventare limitato e doloroso. La malattia degenerativa dell'articolazione del ginocchio più comune è l'osteoartrite (OA)4. Una varietà di fattori di rischio sono noti per predisporre allo sviluppo di OA, tra cui età avanzata, obesità, sesso femminile, traumi articolari e genetica, tra gli altri5,6. Attualmente ci sono circa 14 milioni di persone negli Stati Uniti con OA sintomatica del ginocchio, con la prevalenza in aumento a causa dell'aumento dell'età della popolazione e dei tassi di obesità7,8. Inizialmente considerata una malattia della cartilagine, l'OA è ora intesa come una malattia dell'intera articolazione9. I cambiamenti patologici comunemente osservati nell'OA includono l'erosione della cartilagine articolare, la formazione di osteofiti, l'ispessimento osseo subcondrale e l'infiammazione della sinovia9,10. Poiché non esiste una cura nota per l'OA, i trattamenti si concentrano principalmente sulla gestione dei sintomi (ad esempio, dolore)11,12e una volta che l'OA è progredito allo stadio finale, la chirurgia di sostituzione articolare è spesso indicata13.
Gli interventi chirurgici di sostituzione articolare possono essere sostituzioni parziali o totali del ginocchio, con artroplastica totale del ginocchio (TKA) che include la sostituzione dell'intera articolazione tibiofemorale e dell'articolazione femoro-rotula. A partire dal 2020, circa 1 milione di TKA vengono eseguiti negli Stati Uniti ogni anno14. Durante la TKA, un chirurgo ortopedico risente la porzione superiore del plateau tibiale e i condili femorali inferiori(Figura 2A,2B)per essere dotato di impianti protesici. A volte male interpretato dai pazienti, in un TKA, solo 8-10 mm vengono resecati dall'estremità di ciascun osso, che viene successivamente tappato o riaffiolato, con metallo. Un rivestimento in polietilene interposto forma la superficie del cuscinetto (cioè l'imbottitura) tra i due impianti metallici. Inoltre, diversi componenti dei tessuti molli dell'articolazione vengono completamente o parzialmente asportati per ottenere un corretto equilibrio articolare. Tra questi tessuti ci sono i menisci mediali e laterali (Figura 2C), cuscinetto di grasso infrapatellare (Figura 2D), legamento crociato anteriore (LCA; Figura 2E), sinovia (Figura 2F) e muscolo obliquo vastus medialis (VMO; Figura 2G) 15. Sebbene i TCA siano generalmente efficaci per il trattamento con OA, circa il 20% dei pazienti riferisce il ripetersi del dolore dopo l'intervento chirurgico16. Insieme all'alto costo e alla relativa invasività della procedura, queste limitazioni indicano la necessità di ulteriori ricerche per identificare trattamenti alternativi per mitigare la progressione dell'OA.
Per esplorare i meccanismi di malattia nell'OA che possono presentare nuove strade per l'intervento terapeutico, possono essere utilizzati sistemi sperimentali, tra cui cellule, espianti tissutali e modelli animali. Le cellule sono tipicamente coltivate in monostrato e sono derivate da tessuti primari umani o animali (ad esempio, condrociti isolati dalla cartilagine) o cellule immortalizzate (ad esempio, ATDC517 e CHON-00118). Mentre le cellule possono essere utili per manipolare variabili sperimentali in un ambiente di coltura controllato, non catturano le condizioni dell'articolazione naturale che sono note per avere un impatto sui fenotipi cellulari19. Per ricapitolare meglio la complessa cascata di comunicazione chimica, meccanica e cellula-cellula alla base dell'OA, un'alternativa si trova nei campioni primari di tessuto umano o animale, utilizzati freschi o coltivati ex vivo come espianti, per preservare la struttura tissutale e il microambiente cellulare20. Per studiare l'articolazione in vivo,sono utili anche modelli animali piccoli (ad esempio, topo21) e grandi (ad esempio, cavallo22) per OA (ad esempio, attraverso l'induzione chirurgica, l'alterazione genetica o l'invecchiamento). Tuttavia, la traduzione da questi modelli alla malattia umana può essere limitata da differenze anatomiche, fisiologiche e metaboliche, tra gli altri23. Considerando i vantaggi e gli svantaggi dei sistemi sperimentali, i punti di forza chiave di essere specie-specifici e mantenere la nicchia extracellulare offerta dai tessuti OA umani primari massimizzano il potenziale traslazionale dei risultati della ricerca.
I tessuti OA umani primari possono essere facilmente ottenuti dopo TKA, rendendo l'alta frequenza di TKA una risorsa preziosa per la ricerca. Tra le potenziali applicazioni sperimentali ci sono l'espressione genica e le analisi istologiche. Per realizzare il potenziale dei tessuti OA umani primari per questi approcci di ricerca e altri, delineati sono le seguenti considerazioni chiave. In primo luogo, l'uso di campioni di pazienti è soggetto a regolamentazione etica e i protocolli devono soddisfare le approvazioni dell'Institutional Review Board (IRB)24. In secondo luogo, l'eterogeneità intrinseca dei tessuti primari umani malattia e l'influenza di variabili come l'età e il sesso, tra gli altri, creano la necessità di un'attenta selezione del paziente (cioè l'applicazione di criteri di ammissibilità) e l'interpretazione dei dati. In terzo luogo, le proprietà biologiche uniche di diversi tessuti dell'articolazione (ad esempio, bassa cellularità della cartilagine e del menisco25)possono presentare sfide durante gli esperimenti (ad esempio, isolando alta qualità e quantità di RNA). Questo rapporto affronta queste considerazioni e presenta un protocollo per la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni, l'omogeneizzazione dei tessuti, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità (cioè la valutazione della purezza e dell'integrità dell'RNA; Figura 3) incoraggiare l'uso di tessuti OA umani primari nella comunità di ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

L'osteoartrite (OA) è una malattia articolare cronica e degenerativa che colpisce più spesso il ginocchio. Poiché attualmente non esiste una cura, l'artroplastica totale del ginocchio (TKA) è un intervento chirurgico comune. Esperimenti che utilizzano tessuti OA umani primari ottenuti da TKA forniscono la capacità di studiare i meccanismi della malattia ex vivo. Mentre in precedenza si pensava che l'OA impattasse principalmente sulla cartilagine, ora è noto che ha un impatto su più tessuti nell'articolazione. Questo protocollo descrive la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni, l'omogeneizzazione dei tessuti, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità (basato sulla purezza, l'integrità e la resa dell'RNA) da ciascuno dei sette tessuti unici per supportare l'indagine del meccanismo della malattia nell'articolazione del ginocchio. Con il consenso informato, i campioni sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a TKA per OA. I tessuti sono stati sezionati, lavati e conservati entro 4 ore dall'intervento chirurgico mediante congelamento flash per la fissazione dell'RNA o della formalina per l'istologia. I tessuti raccolti includevano cartilagine articolare, osso subcondrale, menisco, cuscinetto di grasso infrapatellare, legamento crociato anteriore, sinovia e muscolo obliquo vastus medialis. I protocolli di estrazione dell'RNA sono stati testati per ogni tipo di tessuto. La modifica più significativa ha coinvolto il metodo di disintegrazione utilizzato per i tessuti duri a bassa cellula, ad alta matrice (considerati come cartilagine, ossa e menisco) rispetto ai tessuti molli relativamente ad alta cellula, a bassa matrice (considerati come cuscinetto di grasso, legamento, sinovia e muscolo). Si è scoperto che la polverizzazione era appropriata per i tessuti duri e l'omogeneizzazione era appropriata per i tessuti molli. È stata osservata una propensione per alcuni soggetti a produrre valori più elevati di numero di integrità dell'RNA (RIN) rispetto ad altri soggetti in modo coerente su più tessuti, suggerendo che fattori sottostanti come la gravità della malattia possono influire sulla qualità dell'RNA. La capacità di isolare RNA di alta qualità dai tessuti OA umani primari fornisce un modello fisiologicamente rilevante per sofisticati esperimenti di espressione genica, incluso il sequenziamento, che possono portare a intuizioni cliniche che sono più facilmente tradotte per i pazienti.

Sette tessuti unici dell'articolazione del ginocchio umano sono disponibili per la raccolta da pazienti sottoposti a TKA per OA (Figura 1). In questo protocollo, ciascuno di questi tessuti è stato identificato ed elaborato entro 4 ore dalla rimozione chirurgica (Figura 2). Seguendo i passaggi descritti nella Figura 3,porzioni di ciascun tessuto sono state fissate in formalina per la valutazione istologica (Figu...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

I tessuti primari ottenuti da pazienti dopo artroplastica totale del ginocchio forniscono un modello sperimentale per la ricerca sull'osteoartrite con la massima traducibilità clinica. Questo protocollo descrive come identificare, elaborare e isolare l'RNA da sette tessuti del ginocchio unici per supportare l'indagine meccanicistica nell'osteoartrite umana.

Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Questo protocollo incoraggia l'uso di tessuti umani primari come modello clinicamente rilevante per la ricerca sull'osteoartrite. L'esecuzione di analisi di espressione genica e istologica in questi tessuti può fornire nuove intuizioni meccanicistiche. Questa tecnica standardizza i metodi per l'identificazione e l'elaborazione dei componenti dell'articolazione del ginocchio umano.Consente l'estrazione di RNA di alta qualità che soddisfa i requisiti per i saggi di espressione genica a valle. È difficile ottenere RNA di alta qualità da tessuti articolari malati, quindi l'importanza di passaggi apparentemente insignificanti, come mantenere tutto pulito e fresco, non deve essere sottovalutata. A dimostrare la procedura saranno Thomas Wilson, un ricercatore associato e Navdeep Kaur, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.Inizia identificando i tessuti duri, tra cui cartilagine, ossa e menisco e tessuti molli, tra cui cuscinetto di grasso infrapatellare, legamento crociato anteriore, sinovia e vasto muscolo obliquo mediale dal campione in base alle differenze di dimensioni, forma, colore e consistenza. Tagliare ciascuno dei tessuti in tre sezioni. Risciacquare le sezioni di tessuto con PBS sterile per rimuovere eventuali residui o detriti.Per l'estrazione dell'RNA, tagliare ciascuna delle tre sezioni di tessuto in cubi di circa uno o due millimetri. Trasferire i pezzi più piccoli in un flaconcino crio da due millilitro. Dopo aver fissato saldamente i tappi, congelare le fiale immergendo in azoto liquido per 30 secondi, quindi trasferire la fiala nel congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine e ripetere questa procedura per tutti i tessuti.Omogeneizzare il tessuto duro usando un mortaio e un pestello. Prima dell'omogeneizzazione, raffreddare il mortaio, il pestello e la spatola usando azoto liquido per evitare che il campione si scongeli. Elaborare un solo campione alla volta.Trasferire il campione di tessuto sulla malta usando una spatola refrigerata. Versare azoto liquido sulla parte superiore del tessuto. Dopo che l'azoto liquido evapora, schiacciare il tessuto con un pestello.Aggiungere ripetutamente azoto liquido durante la macinazione del tessuto per ottenere polvere di tessuto fine. Trasferire la polvere di tessuto fine in un tubo di microcentrghiera da 1,5 millilitro pre-refrigerato immergendolo in azoto liquido per 30 secondi. Aggiungere un millilitro della soluzione di fenolo di guanidinio acido ghiacciato a ciascun tubo e incubare i tubi sul ghiaccio per 20 minuti.Prima di omogeneizzare diversi tessuti duri, pulire accuratamente il mortaio, il pestello e la spatola con etanolo al 70%, quindi con decontaminante RNasi, seguito da acqua trattata DEPC. Immergere il mortaio, il pestello e la spatola in etanolo al 70%, quindi pulire qualsiasi liquido residuo con un tessuto pulito e privo di lanugine. Omogeneizzare i tessuti molli utilizzando l'omogeneizzatore tissutale.Per disinfettare l'omogeneizzatore, lavare la sonda facendo scorrere tubi di etanolo al 70% e decontaminante RNasi per 30 secondi per lavaggio, quindi lavare con acqua trattata DEPC, seguita da un ulteriore 70% di etanolo, ciascuno per 30 secondi. Pulire qualsiasi liquido residuo con un tessuto pulito e privo di lanugine. Aggiungere un millilitro di soluzione acida di guanidinio fenolo a cinque tubi a fondo tondo pre-etichettati e trasferire il campione di tessuto nel tubo.Posizionare il tubo su ghiaccio durante tutta la procedura e omogeneizzare il tessuto per un massimo di cinque impulsi 32 o fino a quando il tessuto non è visivamente disciolto. Incubare il tessuto omogeneizzato sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni di tessuto non vengono elaborati. Disinfettare e pulire l'omogeneizzatore prima di elaborare il campione di tessuto successivo.Utilizzando una pinca sterile, rimuovere qualsiasi pezzo di tessuto presente nei denti della sonda. Incubare tutto il tessuto omogeneizzato sul ghiaccio per altri 20 minuti e quindi trasferire il campione di tessuto in un tubo di microcentro da 1,5 millilitri pre-etichettato e pre-refrigerato. Sette tessuti unici dell'articolazione del ginocchio umano ottenuti da pazienti con osteoartrite sono stati elaborati entro quattro ore dalla rimozione chirurgica.I tessuti sono stati identificati visivamente e confermati dalla colorazione istologica H&E. Le sezioni di tessuto duro colorate H & E, la cartilagine articolare, l'osso subcondrale e il menisco sono stati visualizzati con sei volte l'ingrandimento e 40 volte l'ingrandimento. Allo stesso modo, le sezioni dei tessuti molli macchiate di H & E, il cuscinetto di grasso infrapatellare, il legamento crociato anteriore, la sinovia e il muscolo obliquo vastus medialis sono stati visualizzati a sei volte l'ingrandimento e poi a 40 volte l'ingrandimento.La valutazione della qualità dell'RNA estratto ha indicato la presenza di campioni di alta qualità basati su integrità, resa e purezza, nonché campioni di bassa qualità, suggerendo che, nonostante l'utilizzo di un metodo ottimizzato, fattori esterni come la gravità della malattia possono influire sulla qualità dell'RNA su diversi tessuti dello stesso paziente. La corretta identificazione di ciascun tipo di tessuto è necessaria per consentire confronti intra e intersettoriali all'interno e tra i campioni dei pazienti, soprattutto data la notevole eterogeneità dei tessuti della malattia primaria. Le tecnologie di sequenziamento sono in rapida evoluzione e l'isolamento di RNA di alta qualità è un prerequisito fondamentale per l'utilizzo di queste tecnologie per svelare i meccanismi tessuto-specifici sottostanti in malattie complesse e croniche come l'osteoartrite.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissezione del cervello di ratto per estrazione RNA o proteine ​​da Regione specifiche del cervello

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Ricerca

Biologia

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Estrazione RNA da cellule Neuroprecursor Utilizzando il Bio-Rad RNA totale Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

L&#39;ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Raccolta, isolamento e di arricchimento di batteri naturalmente presenti magnetotactic dall&#39;ambiente

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...