Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

著者らは、この研究を可能にした研究参加者に感謝し、この報告書を変形性関節症分野の新しい科学者に捧げる。

この研究議定書は承認され、ヘンリーフォード健康システム制度審査委員会(IRB #13995)によって設定された制度ガイドラインに従った。
1. 患者の選択
<ol><li>整形外科医とTKAを受ける予定の患者の中から患者を特定する。</li>
	<li>研究プロトコルで定義された適格性基準に基づいて患者を選択します。包含基準の例としては、18歳以上であることと、変形性膝関節症の確定?...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

提示されたプロトコルは、RNA抽出のための7つの主要なヒトOA組織を収集することに成功したことを証明しました(表1)および組織学的処理(図4)。患者のサンプルを収集する前に、理想的には外科医または外科チームと協力して、IRB承認プロトコルを確立する必要があります。試験片の収集に標準化されたプロトコル(例えば、その場での一貫した切除)を...

膝は人体で最大の滑液関節であり、脛骨と大腿骨と膝蓋骨と大腿骨1の間の膝蓋骨関節との間の脛骨の関節を含む。膝の骨は関節軟骨で覆われ、半月、脂肪、靭帯、筋肉を含む様々な結合組織によって支えられ、滑膜膜は関節全体を封入して滑液充填空洞1、2、3を作り出す(図1)。健康な膝は前部平面1、3の摩擦のない動きを可能にする移動式ヒンジの接合箇所として機能する。病理学的状態下では、動きは制限され、痛みを伴うことがあります。最も一般的な変性膝関節疾患は変形性関節症(OA)4である。OAの発症に大きな影響を与えるさまざまな危険因子が知られています, 高齢者を含みます, 肥満, 女性のセックス, 関節外傷, 遺伝学, とりわけ5,6.現在、米国には症候性膝OAを持つ推定1,400万人が存在し、人口年齢の上昇と肥満率7,8による罹患率が増加しています。当初は軟骨の疾患であると考えられていたが、OAは現在、関節全体9の疾患として理解されている。OAで一般的に観察される病理学的変化は、関節軟骨浸食、骨棘形成、軟骨下骨肥厚、および滑膜9、10の炎症を含む。OAに対する既知の治療法がないため、治療は主に症状(例えば、疼痛)管理11、12に焦点を当て、そしてOAが末期に進行すると、関節置換手術は13を示すことが多い。
関節置換手術は、脛骨性関節関節全体と膝蓋骨関節関節の交換を含む全膝関節形成術(TKA)を伴う部分的または完全な膝置換のいずれかであり得る。2020年現在、米国では毎年約100万件のTKUが実施されています。TKAの間、整形外科医は脛骨台の上部と下腿骨顆(図2A、2B)を補間インプラントで装着するように分け替える。時には患者によって誤解され、TKAでは、各骨の端から8〜10mmしか切除され、その後キャップまたは再浮上し、金属で覆われる。介在ポリエチレンライナーは、2つの金属インプラント間の軸受面(すなわち、パディング)を形成する。さらに、関節のいくつかの軟部組織成分は、適切な関節バランスを達成するために完全または部分的に切除される。これらの組織の中には、内側および外側の月経(図2C)、歯膜脂肪パッド(図2D)、前十字靭帯(ACL;図2E、滑膜(図2F)、及び斜筋(VMO;図2G)TKAは一般的にOA治療に成功しているが、患者の約20%が手術後の痛みの再発を報告する16。高いコストと手順の相対的な侵襲性に加えて、これらの制限は、OAの進行を軽減するための代替治療を特定するためのさらなる研究の必要性を指摘する。
治療介入のための新たな道を提示し得るOAの疾患メカニズムを探求するために、細胞、組織外植物、および動物モデルを含む実験システムを使用することができる。細胞は、典型的には、単層で培養され、原発性ヒトまたは動物組織(例えば、軟骨から単離された軟骨細胞)または不死化細胞(例えば、ATDC517 およびCHON-00118)に由来する。細胞は制御された培養環境で実験変数を操作するのに有用であるが、細胞のフェノタイプ19に影響を与えると知られている自然な関節の条件を捕捉しない。OAの基になる化学的、機械的、および細胞間通信の複雑なカスケードをより良く再現するために、代わりの代替は、一次ヒトまたは動物組織サンプルに見られ、新鮮なまたは培養された ex vivo を外植として使用するかにかかわらず、組織構造および細胞微小環境20を保存する。 生体内で関節を研究するためには、小(例えばマウス21)および大きい(例えば、馬22)OAの動物モデル(例えば、外科的誘導、遺伝的変化、または老化を通じて)も有用である。しかし、これらのモデルからヒト疾患への翻訳は、解剖学的、生理学的、および代謝の違いによって制限され得る。実験システムの長所と短所を考えると、種特異的であることと、一次ヒトOA組織が提供する細胞外ニッチを維持することの主な強みは、研究結果の翻訳可能性を最大化する。
ヒトの初発組織は、TKAに続いて容易に得られ、TKAの高頻度を研究に役立つ貴重な資源とすることができる。潜在的な実験的応用の中には、遺伝子発現および組織学的分析がある。これらの研究アプローチ等に対するヒトの主要OA組織の可能性を実現するために、以下の重要な検討事項を概説する。まず、患者検体の使用は倫理的規制の対象となり、プロトコルは機関審査委員会(IRB)の承認を満たす必要があります。第二に、ヒト原発性疾患組織の固有の異質性と、年齢や性別などの変数の影響は、とりわけ、慎重な患者の選択(すなわち、適格性基準の適用)およびデータ解釈の必要性を生み出す。第三に、関節中の異なる組織の独特な生物学的特性(例えば、軟骨および半月板25の低い細胞性)は、実験中に課題を提示することができる(例えば、RNAの質および量を高く分化する)。このレポートでは、これらの考慮事項に対応し、患者の選択、サンプル処理、組織の均質化、RNA抽出、および品質管理(RNAの純度と完全性の評価)のためのプロトコルを提示します。 図3)研究コミュニティにおける主要ヒトOA組織の使用を奨励する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

変形性関節症(OA)は、最も頻繁に膝に影響を与える慢性および変性関節疾患である。現在のところ治療法がないため、全膝関節形成術(TKA)は一般的な外科的介入である。TKAから得られたヒトの初原OA組織を用いた実験は、疾患メカニズム ex vivoを調査する能力を提供する。OAは以前は主に軟骨に影響を与えると考えられていたが、現在では関節内の複数の組織に影響を与えたことが知られている。このプロトコルは、患者の選択、サンプル処理、組織均質化、RNA抽出、および(RNAの純度、完全性、収率に基づく)品質管理(RNAの純度、完全性、収率に基づく)を、膝関節における疾患メカニズムの調査をサポートする方法を説明します。インフォームド・コンセントを得て、OAのTKAを受けている患者からサンプルを入手した。組織は解剖、洗浄、およびRNAのためのフラッシュ凍結または組織学のためのホルマリン固定によって手術の4時間以内に保存された。収集された組織には、関節軟骨、軟骨下骨、半月板、眼房蓋脂肪パッド、前十字靭帯、滑膜、および斜筋の中科が含まれていた。RNA抽出プロトコルは、各組織タイプについて試験した。最も重要な改変は、比較的高細胞、低マトリックス、低マトリックス、軟部組織(脂肪パッド、靭帯、滑膜、および筋肉と考えられる)に対して、低細胞、高マトリックス、硬組織(軟骨、骨、半月板と考えられる)に使用される崩壊の方法を含んでいた。粉砕は硬質組織に適しており、軟組織には均質化が適していることが分かった。複数の組織にわたって一貫して他の被験者よりも高いRNA完全性数(RIN)値を得るためのプロクチティティが観察され、疾患重症度などの根本的な要因がRNAの質に影響を与える可能性が示唆された。ヒトの原発組織から高品質のRNAを単離する能力は、シーケンシングを含む洗練された遺伝子発現実験に生理学的に関連するモデルを提供し、患者に翻訳されやすい臨床的洞察につながる可能性があります。

OAのTKAを受けている患者から収集するために7つのユニークなヒト膝関節組織が利用可能である(図1)。このプロトコルでは、これらの組織のそれぞれを特定し、外科的除去の4時間以内に処理した(図2)。図3に概説するステップに従って、各組織の部分は組織学的評価のためにホルマリン固定(図4)、他の部?...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

全膝関節形成術後の患者から得られた原発組織は、変形性関節症研究の実験モデルを提供し、最大の臨床翻訳性を有する。このプロトコルは、ヒト変形性関節症における機械治療研究を支援するために、7つのユニークな膝組織からRNAを同定、処理、分離する方法を説明しています。

ヒト変形性膝関節からの組織採取とRNA抽出

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

このプロトコルは、変形性関節症研究のための臨床的に関連するモデルとして、一次ヒト組織の使用を奨励する。これらの組織で遺伝子発現と組織学的解析を行うことは、新たな機械学的洞察を提供するかもしれない。この技術は、ヒト膝関節成分の同定と処理の方法を標準化する。それは下流の遺伝子発現の調査のための条件を満たす高品質のRNAの抽出を可能にする。病気の関節組織から高品質のRNAを得ることは困難であるため、すべてを清潔で涼しく保つなど、一見重要でないステップの重要性を過小評価すべきではありません。この手順を実証するには、トーマス・ウィルソン研究員と私の研究室の博士研究員であるナブディープ・カウルです。まず、軟骨、骨、半月板や軟部組織を含む硬い組織を同定することから始めます, 眼底脂肪パッドを含みます, 前十字靭帯, 滑膜と広大な内側筋肉は、サイズの違いに基づいて、標本から斜視.各組織を3つのセクションに切ります。滅菌PBSで組織切片をすすいで、残留物や破片を除去します。RNA抽出では、3つの組織切片をそれぞれ約1~2ミリメートルの立方体に切り取ります。小さな部分を2ミリリットルのクライオバイアルに移します。キャップをしっかりと固定した後、フラッシュは30秒間液体窒素に沈めることによってバイアルを凍結し、その後、長期保存のためにマイナス80°Cの冷凍庫にバイアルを移し、すべての組織に対してこの手順を繰り返します。モルタルと害虫を使用して硬質組織を均質化します。均質化する前に、液体窒素を使用してモルタル、害虫、へらを冷やし、サンプルが解凍されるのを防ぎます。一度に 1 つのサンプルのみを処理します。冷やしたへらを使用して、組織サンプルをモルタルに移します。組織の上に液体窒素を注ぎます。液体窒素が蒸発した後、害虫で組織を粉砕します。組織を粉砕しながら液体窒素を繰り返し加え、微細組織粉末を得る。液体窒素に30秒間浸して冷やした1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で細かい組織粉末を移す。各チューブに氷冷酸グアニジニウムフェノール溶液を1ミリリットル加え、氷上でチューブを20分間インキュベートします。異なる硬質組織を均質化する前に、70%エタノールでモルタル、害虫およびヘラを徹底的に洗浄し、次にRNaseデコンタミナントを使用し、続いてDEPC処理水を洗浄する。乳鉢、害虫、へらを70%エタノールに浸し、残りの液体を清潔で糸くない組織で拭きます。組織ホモジナイザーを使用して軟組織を均質化する。ホモジナイザーを消毒する場合は、70%エタノールとRNaseデコンタミナントのチューブを1洗浄あたり30秒間実行してプローブを洗浄し、次にDEPC処理水で洗浄し、さらに70%エタノールを追加して30秒間洗浄します。清潔で糸くずのないティッシュで残った液体を拭きます。酸グアニジニウムフェノール溶液を1ミリリットルを事前標識した5ミリリットルの丸底チューブに加え、組織サンプルをチューブに移します。管を氷の上に置き、最大5つの32番目のパルス、または組織が視覚的に溶解するまで組織を均質化します。すべての組織サンプルが処理されるまで、氷の上で均質化された組織をインキュベートします。次の組織サンプルを処理する前にホモジナイザーを消毒し、洗浄してください。滅菌鉗子を使用して、プローブの歯に存在する組織チャンクを除去する。氷上のすべての均質化された組織をさらに20分間インキュベートし、組織サンプルを事前にラベル付けされた1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。変形性関節症患者から得られた7つのユニークなヒト膝関節組織は、外科的除去の4時間以内に処理された。組織を視覚的に同定し、H&E組織学的染色によって確認した。H&E染色硬い組織切片、関節軟骨、軟骨下骨および半月板を6倍の倍率および40倍の倍率で視覚化した。同様に、H&E染色された軟部組織切片、眼底脂肪パッド、前十字靭帯、滑膜及び斜視の粘膜及び斜視の筋肉を6倍の倍率で可視化し、その後40倍の倍率で可視化した。抽出されたRNAの品質評価は、完全性、収量および純度に基づく高品質サンプルの存在を示し、低品質のサンプルを最適化した方法を使用しているにもかかわらず、疾患の重症度などの外部要因が同じ患者の異なる組織全体のRNA品質に影響を与える可能性があることを示唆した。各組織タイプの正しい同定は、特に原発性疾患組織のかなりの不均一性を考えると、患者サンプル内および患者サンプル間の組織間比較を可能にするために必要である。シーケンシング技術は急速に進化しており、これらの技術を使用して変形性関節症のような複雑な慢性疾患の根底にある組織特異的メカニズムを解明するには、高品質のRNAの単離が不可欠です。

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

RNAまたは特定の脳領域からのタンパク質抽出用のラット脳の微小解剖

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio - Rad社のTotal RNA Kitを使​​用してNeuroprecursor細胞からのRNA抽出

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

当然のことながら環境から磁性細菌の発生の収集、分離、濃縮

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 成人皮膚組織からのヒトメラノサイトの収穫量を豊かにする

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

機械評価のためのヒト筋学の上室から骨格筋生検の収集

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...