Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Forfatterne takker studiedeltakerne som gjorde denne forskningen mulig og dedikerer denne rapporten til nye forskere innen slitasjegikt.

Denne studieprotokollen ble godkjent og fulgt av Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).
1. Pasientvalg
<ol><li>Identifiser pasientene blant de som er planlagt å gjennomgå TKA med en ortopedisk kirurg.</li>
	<li>Velg pasientene basert på kvalifikasjonskriteriene som er definert av studieprotokollen. Eksempler på inklusjonskriterier inkluderer å være 18 år eller eldre og ha en bekreftet diagnose av kne slitasjegikt. Eksempler på eksklusjonskriterier inkludere...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

Protokollen som presenteres har vist seg vellykket for å samle syv primære menneskelige OA vev for RNA ekstraksjon (Tabell 1) og histologisk behandling (Figur 4). Før du samler inn pasientprøver, er det nødvendig å etablere en IRB-godkjent protokoll, ideelt i samarbeid med en kirurg eller et kirurgisk team. Bruk av en standardisert protokoll for prøveinnsamling (f.eks. reseksjon fra konsekvente in situ-steder) er avgjørende for å maksimere eksperimentell re...

Kneet er det største synovialleddet i menneskekroppen, som består av tibiofemoralleddet mellom tibia og lårbenet og patellofemoralleddet mellom patella oglårbenet 1. Beinene i kneet er foret med leddbrusk og støttes av ulike bindevev, inkludert menisci, fett, leddbånd og muskler, og en synovialmembran innkapsler hele leddet for å skape et synovial væskefylt hulrom1,2,3 ( figur1). Et sunt kne fungerer som en mobil hengselledd som tillater friksjonsfri bevegelse i frontplan1,3. Under patologiske forhold kan bevegelse bli begrenset og smertefull. Den vanligste degenerative kneleddsykdommen er slitasjegikt (OA)4. En rekke risikofaktorer er kjent for å predisponere for OA-utvikling, inkludert eldre alder, fedme, kvinnelig kjønn, leddtraumer og genetikk, blant annet5,6. Det er for tiden anslagsvis 14 millioner mennesker i USA med symptomatisk kne OA, med utbredelsen økende på grunn av økende befolkningsalder og fedme7,8. Opprinnelig ansett for å være en sykdom i brusk, OA er nå forstått som en sykdom i hele ledd9. Ofte observerte patologiske endringer i OA inkluderer leddbrusk erosjon, osteofyttdannelse, subkondral benfortykning og betennelse i synovium9,10. Siden det ikke er noen kjent kur for OA, fokuserer behandlinger primært på symptom (f.eks. smerte) ledelse11,12, og når OA har utviklet seg til sluttfasen, er felles erstatningskirurgi ofte indikert13.
Felles erstatningsoperasjoner kan enten være delvise eller totale kneutskiftninger, med total kneartrosgistikk (TKA), inkludert utskifting av hele tibiofemoral artikulasjon og patellofemoral ledd. Fra og med 2020 utføres ca. 1 million TBA-er i USA hvert år14. Under TKA resects en ortopedisk kirurg den øvre delen av tibial platået og de nedre femoral condyles (Figur 2A, 2B) som skal utstyres med proteseimplantater. Noen ganger feiltolket av pasienter, i en TKA, blir bare 8-10 mm resected fra slutten av hvert bein, som senere er avkortet eller gjenoppstått, med metall. En interposed polyetylenforing danner lageroverflaten (dvs. polstring) mellom de to metallimplantatene. I tillegg er flere bløtvevskomponenter i leddet helt eller delvis utskilt for å oppnå riktig leddbalanse. Blant disse vevene er medial og lateral menisci (Figur 2C), infrapatellar fettpute (Figur 2D), fremre korsbånd (ACL; Figur 2E), synovium (figur 2F) og vastus medialis skrå muskel (VMO; Figur 2G) 15. Selv om TBA-er generelt er vellykkede for OA-behandling, rapporterer rundt 20% av pasientene tilbakefall av smerte etter operasjonen16. Sammen med den høye prisen og den relative invasiviteten i prosedyren, peker disse begrensningene på behovet for videre forskning for å identifisere alternative behandlinger for å redusere progresjonen av OA.
For å utforske sykdomsmekanismer i OA som kan presentere nye veier for terapeutisk inngrep, kan eksperimentelle systemer, inkludert celler, vevsutløp og dyremodeller brukes. Celler dyrkes vanligvis i monolayer og er avledet fra primær menneskelig eller animalsk vev (f.eks. kondrocytter isolert fra brusk) eller udødelige celler (f.eks. ATDC517 og CHON-00118). Mens celler kan være nyttige for å manipulere eksperimentelle variabler i et kontrollert kulturmiljø, fanger de ikke opp forholdene til det naturlige leddet som er kjent for å påvirke cellefenotyper19. For bedre å rekapitulere den komplekse kaskaden av kjemisk, mekanisk og celle-til-celle kommunikasjon underliggende OA, finnes et alternativ i primære menneskelige eller dyrevevsprøver, enten det brukes frisk eller kultivert ex vivo som explants, for å bevare vevsstruktur og cellemikromiljøet20. For å studere felles in vivo, er små (f.eks. mus21) og store (f.eks. hest22) dyremodeller for OA (f.eks. gjennom kirurgisk induksjon, genetisk endring eller aldring) også nyttige. Oversettelse fra disse modellene til menneskelig sykdom kan imidlertid begrenses av anatomiske, fysiologiske og metabolske forskjeller, blant annet23. Tatt i betraktning fordelene og ulempene ved eksperimentelle systemer, maksimerer de viktigste styrkene ved å være artsspesifikke og opprettholde den ekstracellulære nisjen som tilbys av det primære menneskelige OA-vevet, det translasjonelle potensialet til forskningsfunn.
Primært humant OA-vev kan lett oppnås etter TKA, noe som gjør høy frekvens av TKAer til en verdifull ressurs for forskning. Blant potensielle eksperimentelle anvendelser er genuttrykk og histologiske analyser. For å realisere potensialet i primært humant OA-vev for disse forskningsmetodene og andre, er skissert følgende viktige hensyn. For det første er bruk av pasientprøver underlagt etisk regulering, og protokoller må oppfylle IRB-godkjenninger (Institutional Review Board)24. For det andre skaper den iboende heterogeniteten til humant primærsykdommet vev og påvirkning av variabler som alder og kjønn blant annet behovet for nøye pasientvalg (dvs. anvendelse av kvalifikasjonskriterier) og datatolkning. For det tredje kan de unike biologiske egenskapene til forskjellige vev i leddet (f.eks. lav cellulæritet av brusk og menisk25) by på utfordringer under eksperimenter (f.eks. isolere høy kvalitet og mengde RNA). Denne rapporten tar for seg disse hensynene og presenterer en protokoll for pasientvalg, prøvebehandling, vevshomogenisering, RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll (dvs. vurdering av RNA-renhet og integritet; Figur 3) å oppmuntre til bruk av primært humant OA-vev i forskningsmiljøet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

Slitasjegikt (OA) er en kronisk og degenerativ leddsykdom som oftest påvirker kneet. Siden det for tiden ikke finnes noen kur, er total kneartrosgistikk (TKA) et vanlig kirurgisk inngrep. Eksperimenter ved hjelp av primære menneskelige OA vev hentet fra TKA gir evnen til å undersøke sykdomsmekanismer ex vivo. Mens OA tidligere ble antatt å påvirke hovedsakelig brusk, er det nå kjent å påvirke flere vev i leddet. Denne protokollen beskriver pasientvalg, prøvebehandling, vevshomogenisering, RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll (basert på RNA-renhet, integritet og utbytte) fra hvert av syv unike vev for å støtte sykdomsmekanismeundersøkelse i kneleddet. Med informert samtykke ble det innhentet prøver fra pasienter som gjennomgikk TKA for OA. Vev ble dissekert, vasket og lagret innen 4 timer etter operasjonen ved flashfrysing for RNA eller formalinfiksering for histologi. Samlet vev inkluderte leddbrusk, subkondral bein, menisk, infrapatellar fettpute, fremre korsbånd, synovium og vastus medialis skrå muskel. RNA-ekstraksjonsprotokoller ble testet for hver vevstype. Den viktigste modifikasjonen involverte metoden for oppløsning som brukes til lavcellet, høymatrise, hardt vev (betraktet som brusk, bein og menisk) versus relativt høy celle, lavmatrise, bløtvev (betraktet som fettpute, ligament, synovium og muskel). Det ble funnet at pulverisering var egnet for hardt vev, og homogenisering var egnet for bløtvev. En proclivity for noen å gi høyere RNA integritet nummer (RIN) verdier enn andre forsøkspersoner konsekvent på tvers av flere vev ble observert, noe som tyder på at underliggende faktorer som sykdom alvorlighetsgrad kan påvirke RNA kvalitet. Evnen til å isolere RNA av høy kvalitet fra primært humant OA-vev gir en fysiologisk relevant modell for sofistikerte genuttrykksforsøk, inkludert sekvensering, som kan føre til klinisk innsikt som lettere oversettes til pasienter.

Syv unike leddvev i kneet er tilgjengelig for innsamling fra pasienter som gjennomgår TKA for OA (figur 1). I denne protokollen ble hvert av disse vevene identifisert og behandlet innen 4 timer etter kirurgisk fjerning (figur 2). Etter trinnene som er beskrevet i figur 3, ble deler av hvert vev formalin-fikset for histologisk vurdering (figur 4), mens andre porsjoner ble flash-frosset for RNA-isolasjon...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Primærvev hentet fra pasienter etter total kneartegikt gir en eksperimentell modell for slitasjegiktforskning med maksimal klinisk overførbarhet. Denne protokollen beskriver hvordan du identifiserer, behandler og isolerer RNA fra syv unike knevev for å støtte mekanistisk undersøkelse i human slitasjegikt.

Vevsinnsamling og RNA-ekstraksjon fra den humane osteoarthritic kneleddet

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Denne protokollen oppfordrer til bruk av primært humant vev som en klinisk relevant modell for slitasjegiktforskning. Å utføre genuttrykk og histologiske analyser i disse vevene kan gi ny mekanistisk innsikt. Denne teknikken standardiserer metoder for identifisering og behandling av menneskelige kneleddkomponenter.Det muliggjør utvinning av RNA av høy kvalitet som oppfyller kravene til nedstrøms genuttrykksanalyser. Det er utfordrende å oppnå høy kvalitet RNA fra syke leddvev, så viktigheten av tilsynelatende ubetydelige trinn, for eksempel å holde alt rent og kjølig, bør ikke undervurderes. Å demonstrere prosedyren vil være Thomas Wilson, en forskningsmedarbeider og Navdeep Kaur, postdoktor fra laboratoriet mitt.Begynn med å identifisere det harde vevet, inkludert brusk, bein og menisk og bløtvev, inkludert infrapatellar fettpute, fremre korsbånd, synovium og vastus medialis skrå muskel fra prøven basert på forskjellene i størrelse, form, farge og tekstur. Klipp hvert av vevene i tre seksjoner. Skyll vevsdelene med steril PBS for å fjerne rester eller rusk.For RNA-ekstraksjon, kutt hver av de tre vevsdelene i omtrent en til to millimeter kuber. Overfør de mindre brikkene til et to milliliter cryo hetteglass. Etter å ha sikret hettene tett, flash fryse hetteglassene ved å nedsenke i flytende nitrogen i 30 sekunder, deretter overføre hetteglasset til minus 80 grader Celsius fryser for langsiktig lagring, og gjenta denne prosedyren for alle vev.Homogeniser det harde vevet ved hjelp av en mørtel og pestle. Før homogenisering, avkjøl mørtel, pestle og spatel ved hjelp av flytende nitrogen for å forhindre at prøven tiner. Behandle bare ett eksempel om gangen.Overfør vevsprøven til mørtel ved hjelp av en kjølt spatel. Hell flytende nitrogen på toppen av vevet. Etter at det flytende nitrogenet fordamper, knuser du vevet med en pestle.Tilsett gjentatte ganger flytende nitrogen mens du maler vevet for å oppnå fint vevspulver. Overfør det fine vevspulveret i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør forkjølet ved å senke det ned i flytende nitrogen i 30 sekunder. Tilsett en milliliter av den iskalde guanidiniumfenoloppløsningen til hvert rør og inkuber rørene på is i 20 minutter.Før homogenisering av forskjellig hardt vev, rengjør mørtel, pestle og spatel grundig med 70% etanol, deretter med RNase dekontaminant, etterfulgt av DEPC behandlet vann. Bløtlegg mørtel, pestle og spatel i 70% etanol, tørk deretter eventuell gjenværende væske med et rent, lofritt vev. Homogeniser bløtvevet ved hjelp av vevshomogenisatoren.For desinfisering av homogenisatoren, vask sonden ved å kjøre rør på 70% etanol og RNase dekontaminant i 30 sekunder per vask, vask deretter med DEPC-behandlet vann, etterfulgt av ytterligere 70% etanol, hver i 30 sekunder. Tørk eventuell gjenværende væske med et rent, lofritt vev. Tilsett en milliliter syre guanidinium fenoloppløsning til forhåndsmerkede, fem milliliter runde bunnrør, og overfør vevsprøven inn i røret.Plasser røret på is gjennom hele prosedyren og homogeniser vevet i maksimalt fem 32. Inkuber det homogeniserte vevet på is til alle vevsprøvene er behandlet. Desinfiser og rengjør homogenisatoren før du behandler neste vevsprøve.Bruk sterile tang, fjern eventuelle vevsbiter som er tilstede i sondens tenner. Inkuber alt homogenisert vev på isen i ytterligere 20 minutter og overfør deretter vevsprøven til et forhåndsmerket, forhåndskjølt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Syv unike humane kneleddvev hentet fra slitasjegiktpasienter ble behandlet innen fire timer etter kirurgisk fjerning.Vevet ble identifisert visuelt og bekreftet av H&E histologisk farging. H&E-fargede harde vevsseksjoner, leddbrusk, subkondralben og menisk ble visualisert ved seks ganger forstørrelse og 40 ganger forstørrelse. På samme måte ble H&E-fargede bløtvevsseksjoner, infrapatellarfettpute, fremre korsbånd, synovium og vastus medialis skrå muskel visualisert ved seks ganger forstørrelse og deretter ved 40 ganger forstørrelse.Kvalitetsvurderingen av ekstrahert RNA indikerte tilstedeværelsen av prøver av høy kvalitet basert på integritet, utbytte og renhet, samt prøver av lav kvalitet, noe som tyder på at til tross for bruk av en optimalisert metode, kan eksterne faktorer som alvorlighetsgrad av sykdom påvirke RNA-kvaliteten på tvers av forskjellige vev fra samme pasient. Korrekt identifisering av hver vevstype er nødvendig for å muliggjøre intra- og intervevssammenligninger i og på tvers av pasientprøver, spesielt gitt den betydelige heterogeniteten til primærsykdomsvev. Sekvenseringsteknologier utvikler seg raskt, og isolering av RNA av høy kvalitet er en kritisk forutsetning for å bruke disse teknologiene til å avdekke underliggende vevsspesifikke mekanismer i komplekse, kroniske sykdommer som slitasjegikt.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Innsamling, isolasjon og berikelse av naturlig forekommende Magnetotactic Bakterier fra Miljøverndepartementet

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Utvinning og analyse av kortisol fra Menneske og Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolasjon fra Mouse Pancreas: En Ribonuclease rike Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Utarbeidelse av formalinfiksert parafin-innebygde Tissue-kjerner for både RNA og DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Beriker utbyttet av menneskelige melanocytter fra voksen hudvev

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Innsamling av skjelettmuskulaturbiopsier fra Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for mekanisk evaluering

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...