Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Os autores agradecem aos participantes do estudo que tornaram essa pesquisa possível e dedicam este relatório a novos cientistas no campo da osteoartrite.

Este protocolo de estudo foi aprovado e seguiu as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional do Sistema de Saúde Henry Ford (IRB nº 13995).
1. Seleção de pacientes
<ol><li>Identificar os pacientes entre os agendados para serem submetidos à TKA com um cirurgião ortopédico.</li>
	<li>Selecione os pacientes com base nos critérios de elegibilidade definidos pelo protocolo de estudo. Exemplos de critérios de inclusão incluem ter 18 anos ou mais e ter...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

O protocolo apresentado mostrou-se bem sucedido na coleta de sete tecidos OA humanos primários para extração de RNA(Tabela 1) e processamento histológico(Figura 4). Antes de coletar amostras de pacientes, é necessário estabelecer um protocolo aprovado pelo IRB, idealmente em colaboração com um cirurgião ou equipe cirúrgica. A aplicação de um protocolo padronizado para coleta de amostras (por exemplo, ressecção de locais in situ consistentes) é essenci...

O joelho é a maior articulação sinovial do corpo humano, compreendendo a articulação tibiofemoral entre a tíbia e o fêmur e a articulação patelar entre a patela e o fêmur1. Os ossos do joelho são forrados com cartilagem articular e apoiados por vários tecidos conjuntivos, incluindo menisco, gordura, ligamentos e músculo, e uma membrana sinovial encapsula toda a articulação para criar uma cavidade sintetizada cheia defluidos 1,2,3 (Figura 1). Um joelho saudável funciona como uma articulação de dobradiça móvel que permite movimento sem atrito no plano frontal1,3. Em condições patológicas, o movimento pode se tornar restrito e doloroso. A doença degenerativa mais comum nas articulações do joelho é a osteoartrite (AA)4. Sabe-se que uma variedade de fatores de risco predispõem ao desenvolvimento de OA, incluindo idade mais avançada, obesidade, sexo feminino, trauma articular e genética, entre outros5,6. Atualmente, estima-se que existam 14 milhões de pessoas nos EUA com OA sintomático do joelho, com a prevalência aumentando devido ao aumento da idade populacional e às taxas de obesidade7,8. Inicialmente considerada uma doença da cartilagem, a OA agora é entendida como uma doença de toda a articulação9. As alterações patológicas comumente observadas na OA incluem erosão articular da cartilagem, formação de osteofitas, espessamento ósseo subcondral e inflamação do sinolário9,10. Como não há cura conhecida para OA, os tratamentos focam principalmente no tratamento de sintomas (por exemplo, dor)11,12, e uma vez que o OA progrediu para o estágio final, a cirurgia de substituição articular é frequentemente indicada13.
As cirurgias de substituição articular podem ser substituições parciais ou totais do joelho, com artroplastia total do joelho (TKA), incluindo a substituição de toda a articulação tibiofemoral e a articulação patelar. A partir de 2020, aproximadamente 1 milhão de TKAs são realizados nos EUA a cada ano14. Durante a TKA, um cirurgião ortopédico resseca a porção superior do platô tibial e os condyles femorais inferiores(Figura 2A, 2B) a serem equipados com implantes protéticos. Às vezes mal interpretado pelos pacientes, em um TKA, apenas 8-10 mm é ressecado a partir da extremidade de cada osso, que é posteriormente tampado ou ressurgido, com metal. Um forro de polietileno interposto forma a superfície de rolamento (ou seja, estofamento) entre os dois implantes metálicos. Além disso, vários componentes de tecido mole da articulação são total ou parcialmente extirpados para alcançar o equilíbrio articular adequado. Entre esses tecidos estão o menisco medial e lateral(Figura 2C),bloco de gordura infrapator(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E), sinovia(Figura 2F), e vasto músculo oblíquo de vastus medialis (VMO; Figura 2G) 15. Embora os TKAs sejam geralmente bem sucedidos para o tratamento de OA, cerca de 20% dos pacientes relatam recorrência de dor pós-cirurgia16. Juntamente com o alto custo e a invasividade relativa do procedimento, essas limitações apontam para a necessidade de novas pesquisas para identificar tratamentos alternativos para mitigar a progressão da OA.
Para explorar mecanismos de doenças em OA que possam apresentar novos caminhos para a intervenção terapêutica, podem ser utilizados sistemas experimentais, incluindo células, explantas teciduais e modelos animais. As células são tipicamente cultivadas em monocamadas e são derivadas de tecidos humanos ou animais primários (por exemplo, condrócitos isolados da cartilagem) ou células imortalizadas (por exemplo, ATDC517 e CHON-00118). Embora as células possam ser úteis para manipular variáveis experimentais em um ambiente de cultura controlada, elas não capturam condições da articulação natural que são conhecidas por impactar fenótiposcelulares 19. Para recapitular melhor a complexa cascata de comunicação química, mecânica e célula-celular subjacente OA, uma alternativa é encontrada em amostras primárias de tecido humano ou animal, sejam elas usadas como explants frescas ou cultivadas, para preservar a estrutura tecidual e o microambientecelular 20. Para estudar a articulação in vivo,pequenos (por exemplo, mouse21) e grandes (por exemplo, cavalo22) modelos animais para OA (por exemplo, por indução cirúrgica, alteração genética ou envelhecimento) também são úteis. No entanto, a tradução desses modelos para a doença humana pode ser limitada por diferenças anatômicas, fisiológicas e metabólicas, entre outras23. Considerando as vantagens e desvantagens dos sistemas experimentais, os principais pontos fortes de serem específicos das espécies e manter o nicho extracelular oferecido pelos tecidos OA humanos primários maximizam o potencial translacional dos achados da pesquisa.
Tecidos OA humanos primários podem ser facilmente obtidos após a TKA, tornando a alta frequência de TKAs um recurso valioso para a pesquisa. Entre as aplicações experimentais potenciais estão expressão genética e análises histológicas. Para perceber o potencial dos tecidos OA humanos primários para essas abordagens de pesquisa e outros, delineados são as seguintes considerações-chave. Em primeiro lugar, o uso de amostras de pacientes está sujeito a regulação ética, e os protocolos devem atender às aprovações do Conselho de Revisão Institucional (IRB)24. Em segundo lugar, a heterogeneidade inerente aos tecidos primários doentes humanos e a influência de variáveis como idade e sexo, entre outras, criam a necessidade de seleção cuidadosa do paciente (ou seja, aplicação de critérios de elegibilidade) e interpretação dos dados. Em terceiro lugar, as propriedades biológicas únicas de diferentes tecidos na articulação (por exemplo, baixa celularidade da cartilagem e menisco25) podem apresentar desafios durante os experimentos (por exemplo, isolando alta qualidade e quantidade de RNA). Este relatório aborda essas considerações e apresenta um protocolo para seleção de pacientes, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (ou seja, avaliação da pureza e integridade do RNA; Figura 3) para incentivar o uso de tecidos OA humanos primários na comunidade de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica e degenerativa que mais frequentemente afeta o joelho. Como atualmente não há cura, a artroplastia total do joelho (TKA) é uma intervenção cirúrgica comum. Experimentos com tecidos OA humanos primários obtidos da TKA fornecem a capacidade de investigar mecanismos de doença ex vivo. Embora o OA tenha sido pensado anteriormente para impactar principalmente a cartilagem, agora é conhecido por impactar múltiplos tecidos na articulação. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (com base na pureza, integridade e rendimento do RNA) de cada um dos sete tecidos únicos para apoiar a investigação do mecanismo da doença na articulação do joelho. Com consentimento informado, foram obtidas amostras de pacientes submetidos à TKA para OA. Os tecidos foram dissecados, lavados e armazenados dentro de 4h de cirurgia por congelamento de flash para fixação de RNA ou formalina para histologia. Os tecidos coletados incluíam cartilagem articular, osso subcondral, menisco, almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, sinodio e músculo oblíquo vasto medialis. Os protocolos de extração de RNA foram testados para cada tipo de tecido. A modificação mais significativa envolveu o método de desintegração usado para tecidos duros de baixa célula, alta matriz (considerados como cartilagem, osso e menisco) versus células relativamente altas, baixa matriz, tecidos moles (considerados como almofada de gordura, ligamento, sinodio e músculo). Verificou-se que a pulverização era adequada para tecidos duros, e a homogeneização era apropriada para tecidos moles. Observou-se uma propensão para alguns sujeitos de produzir valores de número de integridade de RNA (RIN) mais elevados do que outros sujeitos consistentemente em múltiplos tecidos, sugerindo que fatores subjacentes, como a gravidade da doença, podem impactar a qualidade do RNA. A capacidade de isolar o RNA de alta qualidade dos tecidos OA humanos primários fornece um modelo fisiologicamente relevante para experimentos sofisticados de expressão genética, incluindo sequenciamento, que podem levar a insights clínicos que são mais facilmente traduzidos para os pacientes.

Sete tecidos articulares humanos únicos estão disponíveis para coleta de pacientes submetidos a TKA para OA(Figura 1). Neste protocolo, cada um desses tecidos foi identificado e processado dentro de 4h de remoção cirúrgica(Figura 2). Seguindo as etapas descritas na Figura 3,as porções de cada tecido foram fixadas para avaliação histológica(Figura 4),enquanto outras porções foram congeladas ...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Os tecidos primários obtidos de pacientes após a artroplastia total do joelho fornecem um modelo experimental para a pesquisa da osteoartrite com tradução clínica máxima. Este protocolo descreve como identificar, processar e isolar o RNA de sete tecidos únicos do joelho para apoiar a investigação mecanicista na osteoartrite humana.

Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Este protocolo incentiva o uso de tecidos humanos primários como um modelo clinicamente relevante para a pesquisa da osteoartrite. A realização de expressões genéticas e análises histológicas nesses tecidos pode fornecer novos insights mecanicistas. Esta técnica padroniza métodos para identificação e processamento de componentes da articulação do joelho humano.Permite a extração de RNA de alta qualidade que atenda aos requisitos para ensaios de expressão genética a jusante. É desafiador obter RNA de alta qualidade de tecidos articulares doentes, de modo que a importância de passos aparentemente insignificantes, como manter tudo limpo e frio não deve ser subestimado. Demonstrando o procedimento estarão Thomas Wilson, um pesquisador associado e Navdeep Kaur, um pós-doutorando do meu laboratório.Comece pela identificação dos tecidos duros, incluindo cartilagem, osso e menisco e tecidos moles, incluindo almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, synovium e vasto músculo oblíquo do espécime com base nas diferenças de tamanho, forma, cor e textura. Corte cada um dos tecidos em três seções. Enxágüe as seções teciduais com PBS estéril para remover qualquer resíduo ou detrito.Para extração de RNA, corte cada uma das três seções teciduais em cubos de aproximadamente um a dois milímetros. Transfira as peças menores para um frasco crioliter de dois mililitros. Depois de fixar as tampas firmemente, o flash congele os frascos submergindo em nitrogênio líquido por 30 segundos, em seguida, transfira o frasco para o congelador de menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo, e repita este procedimento para todos os tecidos.Homogeneize o tecido duro usando uma argamassa e pilão. Antes da homogeneização, esfrie a argamassa, pilão e espátula usando nitrogênio líquido para evitar que a amostra descongele. Processe apenas uma amostra de cada vez.Transfira a amostra de tecido para argamassa usando uma espátula gelada. Despeje nitrogênio líquido em cima do tecido. Depois que o nitrogênio líquido evaporar, esmague o tecido com um pilão.Adicione repetidamente nitrogênio líquido enquanto moe o tecido para obter pó de tecido fino. Transfira o pó de tecido fino em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro pré-refrigerado submergindo em nitrogênio líquido por 30 segundos. Adicione um mililitro da solução de fenól de guanidinium ácido gelado a cada tubo e incubar os tubos no gelo por 20 minutos.Antes de homogeneizar diferentes tecidos duros, limpe bem a argamassa, pilão e espátula com 70% de etanol, depois com descontaminante RNase, seguida pela água tratada da DEPC. Mergulhe a argamassa, pilão e espátula em 70% de etanol, depois limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e livre de fiapos. Homogeneize o tecido mole usando o homogeneizador de tecido.Para desinfetar o homogeneizador, lave a sonda com tubos de 70% de etanol e RNase descontaminante por 30 segundos por lavagem, depois lave com água tratada DEPC, seguida de um adicional de 70% de etanol, cada um por 30 segundos. Limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e sem fiapos. Adicione um mililitro de solução de fenol de guanidinium ácido para tubos de fundo redondos pré-rotulados, cinco mililitros, e transfira a amostra de tecido para o tubo.Coloque o tubo no gelo durante todo o procedimento e homogeneize o tecido por um máximo de cinco pulsos 32, ou até que o tecido sejalvido visualmente. Incubar o tecido homogeneizado no gelo até que todas as amostras de tecido sejam processadas. Desinfete e limpe o homogeneizador antes de processar a próxima amostra de tecido.Usando fórceps estéreis, remova qualquer pedaço de tecido presente nos dentes da sonda. Incubar todo o tecido homogeneizado no gelo por mais 20 minutos e, em seguida, transferir a amostra de tecido para um tubo de micro centrífuga pré-rotulado, pré-refrigerado de 1,5 mililitro. Sete tecidos articulares humanos únicos obtidos de pacientes com osteoartrite foram processados dentro de quatro horas após a remoção cirúrgica.Os tecidos foram identificados visualmente e confirmados pela coloração histológica da H&E. As seções de tecido duro manchados de H&E, cartilagem articular, osso subcondral e menisco foram visualizadas em seis vezes a ampliação e 40 vezes a ampliação. Da mesma forma, as seções de tecido mole manchado de H&E, almofada de gordura infrapaelar, ligamento cruzado anterior, sinovium e músculo oblíquo vasto medialis foram visualizados em seis vezes a ampliação e, em seguida, a 40 vezes a ampliação.A avaliação da qualidade do RNA extraído indicou a presença de amostras de alta qualidade baseadas em integridade, rendimento e pureza, bem como amostras de baixa qualidade, sugerindo que, apesar do uso de um método otimizado, fatores externos como a gravidade da doença podem impactar a qualidade do RNA em diferentes tecidos do mesmo paciente. A identificação correta de cada tipo de tecido é necessária para permitir comparações intra e interseção de tecidos dentro e entre amostras de pacientes, especialmente dada a considerável heterogeneidade dos tecidos da doença primária. As tecnologias de sequenciamento estão evoluindo rapidamente, e o isolamento do RNA de alta qualidade é um pré-requisito crítico para o uso dessas tecnologias para desvendar mecanismos específicos do tecido subjacente em doenças crônicas complexas como a osteoartrite.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissecção de cérebro de um rato para RNA ou Extração de Proteína da região específica do cérebro

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Biologia

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Extração de RNA a partir de células Neuroprecursor Usando o Bio-Rad Total de RNA Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...