Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Авторы благодарят участников исследования, которые сделали это исследование возможным, и посвящают этот отчет новым ученым в области остеоартрита.

Этот протокол исследования был одобрен и следовал институциональным руководящим принципам, установленным Советом по институциональному обзору системы здравоохранения Генри Форда (IRB #13995).
1. Подбор пациента
<ol><li>Определите пациентов из числа тех, кто должен пройти TKA с ?...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

Представленный протокол оказался успешным для сбора семи первичных тканей ОА человека для экстракции РНК(таблица 1)и гистологической обработки(рисунок 4). Перед сбором образцов пациента необходимо установить протокол, одобренный IRB, в идеале в сотрудничестве с...

Колено является самым большим синовиальным суставом в организме человека, состоящим из большеберцового бедренного сустава между большеберцовой и бедренной голенями и надколенника между коленной чашечкой и бедреннойкостью 1. Кости в колене выстрены суставным хрящом и поддерживаются различными соединительными тканями, включая мениски, жир, связки и мышцы, а синовиальная мембрана инкапсулирует весь сустав для создания заполненной синовиальной жидкостью полости1,2,3 (рисунок 1). Здоровое колено функционирует как подвижное шарнирное соединение, которое позволяет беспрепятственно передергиваться в лобной плоскости1,3. При патологических состояниях движение может стать ограниченным и болезненным. Наиболее распространенным дегенеративным заболеванием коленного сустава является остеоартрит (ОА)4. Известно, что различные факторы риска предрасполагают к развитию ОА, включая пожилой возраст, ожирение, женский пол, травму суставов и генетику, среди прочих5,6. В настоящее время, по оценкам, в США с симптоматическим ОА коленного сустава насчитывается 14 миллионов человек, причем распространенность увеличивается из-за роста возраста населения и показателей ожирения7,8. Первоначально считавшийся заболеванием хряща, ОА теперь понимается как заболевание всего сустава9. Обычно наблюдаемые патологические изменения при ОА включают эрозию суставного хряща, образование остеофита, утолщение субхондральной кости и воспаление синовиальнойчасти 9,10. Поскольку не существует известного лечения ОА, лечение в основном сосредоточено на лечении симптомов (например, боли)11,12,и как только ОА прогрессирует до конечной стадии, операция по замене сустава часто указывается13.
Операции по замене сустава могут быть частичной или полной заменой коленного сустава, с полной артропластикой коленного сустава (TKA), включая замену всего тибиофеморального сочленения и пателлофеморального сустава. По состоянию на 2020 год в США ежегодно выполняется около 1 миллиона ТКА14. Во время TKA хирург-ортопед резецирует верхнюю часть плато большеберцовой кости и нижние мыщелки бедренной кости(рисунок 2A,2B),которые должны быть установлены протезными имплантатами. Иногда неправильно интерпретируемые пациентами, в ТКА только 8-10 мм резецируется с конца каждой кости, которая впоследствии укупоривается или всплывается металлом. Вставной полиэтиленовый вкладыш образует несущую поверхность (т.е. прокладку) между двумя металлическими имплантатами. Кроме того, несколько компонентов мягких тканей сустава полностью или частично иссякают для достижения правильного баланса сустава. К числу этих тканей относятся медиал и латеральные мениски(рисунок 2С),инфрапателлярная жироваяподушка (рисунок 2D),передняя крестообразная связка (ПКС; Рисунок 2E),синовиум(Рисунок 2F)и vastus medialis косая мышца (VMO; Рисунок 2G) 15. Хотя ТКА, как правило, успешны для лечения ОА, около 20% пациентов сообщают о повторном возникновении боли после операции16. Наряду с высокой стоимостью и относительной инвазивностью процедуры, эти ограничения указывают на необходимость дальнейших исследований для выявления альтернативных методов лечения для смягчения прогрессирования ОА.
Для изучения механизмов заболевания при ОА, которые могут представлять новые возможности для терапевтического вмешательства, могут быть использованы экспериментальные системы, включая клетки, тканевые экспланты и животные модели. Клетки обычно культивируются в монослое и получают из первичных тканей человека или животных (например, хондроцитов, выделенных из хряща) или увековеченных клеток (например, ATDC517 и CHON-00118). Хотя клетки могут быть полезны для манипулирования экспериментальными переменными в контролируемой среде культуры, они не захватывают условия естественного сустава, которые, как известно, влияют на фенотипы клеток19. Чтобы лучше резюмировать сложный каскад химической, механической и межклеточной коммуникации, лежащей в основе ОА, альтернатива найдена в первичных образцах тканей человека или животных, независимо от того, используются ли они в свежем или культивируемом ex vivo в качестве эксплантов, для сохранения структуры ткани и микроокружения клеток20. Для изучения сустава in vivoтакже полезны маленькие (например, мышь21)и большие (например, лошадь22)животные модели для ОА (например, посредством хирургической индукции, генетического изменения или старения). Однако перевод от этих моделей к заболеваниям человека может быть ограничен анатомическими, физиологическими и метаболическими различиями, среди прочих23. Учитывая преимущества и недостатки экспериментальных систем, ключевые сильные стороны видовой специфики и поддержания внеклеточной ниши, предлагаемой первичными тканями ОА человека, максимизируют трансляционный потенциал результатов исследований.
Первичные ткани ОА человека могут быть легко получены после ТКА, что делает высокую частоту ТКА ценным ресурсом для исследований. Среди потенциальных экспериментальных применений — экспрессия генов и гистологический анализ. Чтобы реализовать потенциал первичных тканей ОА человека для этих исследовательских подходов и других, изложены следующие ключевые соображения. Во-первых, использование образцов пациентов подлежит этическому регулированию, и протоколы должны соответствовать утверждениям Институционального наблюдательного совета (IRB)24. Во-вторых, присущая человеку гетерогенность первичных пораженных тканей и влияние таких переменных, как возраст и пол, среди прочего, создают необходимость тщательного отбора пациентов (т.е. применения критериев приемлемости) и интерпретации данных. В-третьих, уникальные биологические свойства различных тканей в суставе (например, низкая клеточность хряща и мениска25)могут представлять проблемы во время экспериментов (например, выделение высокого качества и количества РНК). В этом отчете рассматриваются эти соображения и представлен протокол для отбора пациентов, обработки образцов, гомогенизации тканей, экстракции РНК и контроля качества (т.е. оценки чистоты и целостности РНК; Рисунок 3) поощрять использование первичных тканей ОА человека в исследовательском сообществе.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

Остеоартрит (ОА) является хроническим и дегенеративным заболеванием суставов, чаще всего поражающим коленное. Поскольку в настоящее время нет лечения, тотальная эндопротезирование коленного сустава (ТКА) является распространенным хирургическим вмешательством. Эксперименты с использованием первичных тканей ОА человека, полученных из ТКА, дают возможность исследовать механизмы заболевания ex vivo. В то время как ранее считалось, что ОА влияет в основном на хрящ, теперь известно, что он влияет на несколько тканей в суставе. Этот протокол описывает отбор пациента, обработку образцов, гомогенизацию тканей, экстракцию РНК и контроль качества (на основе чистоты, целостности и выхода РНК) из каждой из семи уникальных тканей для поддержки исследования механизма заболевания в коленном суставе. С информированного согласия образцы были получены от пациентов, перенесших ТКА для ОА. Ткани рассекались, промывались и хранились в течение 4 ч после операции путем мгновенного замораживания для фиксации РНК или формалина для гистологии. Собранные ткани включали суставной хрящ, субхондральную кость, мениск, инфрапателларную жировую прокладку, передовую крестообразную связку, синовиальную часть и косую мышцу vastus medialis. Протоколы экстракции РНК были протестированы для каждого типа ткани. Наиболее значительная модификация включала метод распада, используемый для низкоклеточных, высокоматричных, твердых тканей (рассматриваемых как хрящ, кость и мениск) по сравнению с относительно высококлеточными, низкоматриксными, мягкими тканями (рассматриваемыми как жировая подушка, связка, синовий и мышца). Было обнаружено, что измельчение подходит для твердых тканей, а гомогенизация подходит для мягких тканей. Наблюдалась склонность некоторых субъектов давать более высокие значения целостности РНК (RIN), чем у других субъектов, последовательно в нескольких тканях, предполагая, что основные факторы, такие как тяжесть заболевания, могут влиять на качество РНК. Способность выделять высококачественную РНК из первичных тканей ОА человека обеспечивает физиологически релевантную модель для сложных экспериментов по экспрессии генов, включая секвенирование, которые могут привести к клиническим выводам, которые легче транслируются пациентам.

Семь уникальных тканей коленного сустава человека доступны для сбора у пациентов, проходящих TKA для ОА(рисунок 1). В этом протоколе каждая из этих тканей была идентифицирована и обработана в течение 4 ч после хирургического удаления(рисунок 2). Следуя шага?...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint at JoVE.com

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Первичные ткани, полученные от пациентов после тотальной эндопротезирования коленного сустава, обеспечивают экспериментальную модель для исследования остеоартрита с максимальной клинической переводимостью. Этот протокол описывает, как идентифицировать, обрабатывать и изолировать РНК из семи уникальных тканей коленного сустава для поддержки механистического исследования остеоартрита человека.

Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Этот протокол поощряет использование первичных тканей человека в качестве клинически значимой модели для исследований остеоартрита. Выполнение экспрессии генов и гистологического анализа в этих тканях может обеспечить новые механистические идеи. Этот метод стандартизирует методы идентификации и обработки компонентов коленного сустава человека.Это позволяет извлекать высококачественную РНК, которая соответствует требованиям к последующим анализам экспрессии генов. Получить высококачественную РНК из больных суставных тканей сложно, поэтому важность, казалось бы, незначительных шагов, таких как поддержание всего в чистоте и прохладе, не следует недооценивать. Продемонстрировать процедуру будут Томас Уилсон, научный сотрудник и Навдип Каур, постдокторант из моей лаборатории.Начните с идентификации твердых тканей, включая хрящи, кости и мениски и мягкие ткани, включая инфрапателларную жировую прокладку, переднюю крестообразную связку, синовиальную и косую мышцу vastus medialis из образца на основе различий в размере, форме, цвете и текстуре. Разрежьте каждую из тканей на три части. Промойте участки тканей стерильным PBS, чтобы удалить остатки или мусор.Для экстракции РНК разрежьте каждый из трех участков ткани примерно на один-два миллиметровых куба. Переложите более мелкие кусочки в двухмиллилитровой криобиржец. Плотно закрепив колпачки, во вспышке заморозьте флаконы, погружаясь в жидкий азот на 30 секунд, затем перенесите флакон в морозильную камеру при минус 80 градусах Цельсия для длительного хранения и повторите эту процедуру для всех тканей.Гомогенизируйте твердую ткань с помощью ступки и пестиков. Перед гомогенизацией охладите ступку, пестик и шпатель, используя жидкий азот, чтобы предотвратить оттаивание образца. Обрабатывайте только один образец за раз.Перенесите образец ткани в раствор с помощью охлажденного шпателя. Сверху на ткани вылейте жидкий азот. После того, как жидкий азот испарится, раздавите ткань пестиком.Многократно добавляйте жидкий азот при измельчении ткани для получения мелкодисперсного порошка. Перенесите мелкодисперсный порошок в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, предварительно охлажденную погружающейся в жидкий азот на 30 секунд. Добавьте по одному миллилитру ледяного раствора гуанидиниумфенола в каждую трубку и инкубировать трубки на льду в течение 20 минут.Перед гомогенизацией различных твердых тканей тщательно очистите раствор, пестик и шпатель 70% этанолом, затем обеззараживающим РНКазой, а затем водой, обработанной DEPC. Замочите ступку, пестик и лопатку в 70% этаноле, затем протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью. Гомогенизировать мягкие ткани с помощью тканевого гомогенизатора.Для дезинфекции гомогенизатора промывайте зонд с помощью прогонов с 70% этанола и обеззараживающего РНКазы в течение 30 секунд на одну промывку, затем промывайте водой, обработанной DEPC, а затем дополнительно 70% этанолом, каждый в течение 30 секунд. Протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью. Добавьте один миллилитр раствора фенола кислоты гуанидиниума в предварительно маркированные пять миллилитровых пробирок с круглым дном и перенесите образец ткани в пробирку.Поместите трубку на лед на протяжении всей процедуры и гомогенизируйте ткань максимум на пять 32-х импульсов или до тех пор, пока ткань визуально не растворится. Инкубировать гомогенизированную ткань на льду до тех пор, пока все образцы тканей не будут обработаны. Продезинфицируйте и очистите гомогенизатор перед обработкой следующего образца ткани.Используя стерильные щипцы, удалите любой кусок ткани, присутствующий в зубах зонда. Инкубировать всю гомогенизированную ткань на льду в течение дополнительных 20 минут, а затем перенести образец ткани в предварительно маркированную, предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра. Семь уникальных тканей коленного сустава человека, полученных от пациентов с остеоартритом, были обработаны в течение четырех часов после хирургического удаления.Ткани были идентифицированы визуально и подтверждены гистологическим окрашиванием H&E. Окрашенные H&E участки твердых тканей, суставной хрящ, субхондральная кость и мениск были визуализированы с шестикратным увеличением и 40-кратным увеличением. Аналогичным образом, окрашенные H&E участки мягких тканей, инфрапателлярная жировая прокладка, передняя крестообразная связка, синовиальная и косая мышца vastus medialis были визуализированы при шестикратном увеличении, а затем при 40-кратном увеличении.Оценка качества экстрагированной РНК показала наличие образцов высокого качества, основанных на целостности, выходе и чистоте, а также образцов низкого качества, предполагая, что, несмотря на использование оптимизированного метода, внешние факторы, такие как тяжесть заболевания, могут влиять на качество РНК в разных тканях одного и того же пациента. Правильная идентификация каждого типа тканей необходима для обеспечения внутри- и межтканевых сравнений внутри и между образцами пациентов, особенно учитывая значительную гетерогенность тканей первичного заболевания. Технологии секвенирования быстро развиваются, и выделение высококачественной РНК является критически важной предпосылкой для использования этих технологий для разгадки основных тканеспецифических механизмов при сложных хронических заболеваниях, таких как остеоартрит.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Микро-рассечение мозга крысы для РНК или белка Извлечение из конкретного региона мозга

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

РНК Извлечение из Neuroprecursor ячеек с использованием Bio-Rad Всего РНК Kit

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Сбор, выделение и обогащение природного происхождения магнитотактических бактерий из окружающей среды

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Добыча и Анализ кортизола от человека и обезьян волос

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Выделение РНК от мыши поджелудочной железы: Рибонуклеаза богатых тканей

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Получение формалином фиксированных залитых парафином тканей Ядра как для РНК и ДНК экстракции

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 обогащает урожайность меланоцитов человека из тканей кожи взрослого человека

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Коллекция скелетных биопсий мышц из Высшего отсека человеческого мускулуса Tibialis перед механической оценкой

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...