Name: tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00
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Los autores agradecen a los participantes del estudio que hicieron posible esta investigación y dedican este informe a los nuevos científicos en el campo de la osteoartritis.

Este protocolo de estudio fue aprobado y siguió las pautas institucionales establecidas por la Junta de Revisión Institucional del Sistema de Salud Henry Ford (IRB # 13995).
1. Selección de pacientes
<ol><li>Identifique a los pacientes de entre los programados para someterse a TKA con un cirujano ortopédico.</li>
	<li>Seleccionar a los pacientes en función de los criterios de elegibilidad definidos por el protocolo del estudio. Ejemplos de criterios de inclusión incluyen tener 18 años...

<ol>
	<li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).</li><li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation:+recent+advances,+but+many+lingering+mysteries.">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li><li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy, Hinge Joints. , (2020).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism.">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044 (2017).</li><li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis.">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li><li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology,+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis.">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li><li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis:+survey+and+cohort+data.">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li><li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us:+impact+of+race+and+ethnicity,+age,+sex,+and+obesity.">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care &amp; Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders.">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li><li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee,+hip,+and+polyarticular+osteoarthritis.">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li><li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+College+of+Rheumatology/Arthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand,+Hip,+and+knee.">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care &amp; Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li><li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+etiology,+diagnosis,+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee.">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li><li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States:+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample.">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li><li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Knee+Replacement+Techniques.">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Atdc5+cells:+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation.">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li><li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi/Nf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression.">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).</li><li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis.">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li><li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+(dmm)+model+of+osteoarthritis+in+the+129/Svev+mouse.">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li><li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis.">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone &amp; Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li><li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Osteoarthritis:+The+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li><li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens.">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).</li><li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo.">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7 (2010).</li><li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular,+dense+connective+tissues.">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li><li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+science+of+human+knee+menisci:+structure,+composition,+and+function.">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li><li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+science+of+articular+cartilage.">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li><li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage.">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li><li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation.">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rin:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements.">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study.">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li><li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples.">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li><li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq:+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses.">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).</li><li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+synovium.">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+and+analysis.">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis:+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease.">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).</li></ol>

El protocolo presentado ha demostrado ser exitoso para la recolección de siete tejidos primarios de OA humana para la extracción de ARN(Tabla 1)y el procesamiento histológico(Figura 4). Antes de recolectar muestras de pacientes, es necesario establecer un protocolo aprobado por el IRB, idealmente en colaboración con un cirujano o equipo quirúrgico. La aplicación de un protocolo estandarizado para la recolección de muestras (por ejemplo, la resección desde ubicaciones...

La rodilla es la articulación sinovial más grande del cuerpo humano, que comprende la articulación tibiofemoral entre la tibia y el fémur y la articulación patelofemoral entre la rótula y el fémur1. Los huesos de la rodilla están revestidos con cartílago articular y soportados por varios tejidos conectivos, incluidos meniscos, grasa, ligamentos y músculos, y una membrana sinovial encapsula toda la articulación para crear una cavidad llena de líquido sinovial1,2,3 (Figura 1). Una rodilla sana funciona como una articulación de bisagra móvil que permite un movimiento sin fricción en el plano frontal1,3. En condiciones patológicas, el movimiento puede volverse restringido y doloroso. La enfermedad degenerativa de la articulación de la rodilla más común es la osteoartritis (OA)4. Se sabe que una variedad de factores de riesgo predisponen al desarrollo de OA, incluida la edad avanzada, la obesidad, el sexo femenino, el trauma articular y la genética, entre otros5,6. Actualmente se estima que hay 14 millones de personas en los Estados Unidos con OA de rodilla sintomática, con la prevalencia aumentando debido al aumento de la edad de la población y las tasas de obesidad7,8. Inicialmente considerada como una enfermedad del cartílago, la OA ahora se entiende como una enfermedad de toda la articulación9. Los cambios patológicos comúnmente observados en la OA incluyen erosión del cartílago articular, formación de osteofitos, engrosamiento óseo subcondral e inflamación de la membrana sinovial9,10. Dado que no existe una cura conocida para la OA, los tratamientos se centran principalmente en el manejo de los síntomas (por ejemplo, dolor)11,12, y una vez que la OA ha progresado a la etapa final, la cirugía de reemplazo articular a menudo está indicada13.
Las cirugías de reemplazo articular pueden ser reemplazos parciales o totales de rodilla, con artroplastia total de rodilla (TKA) que incluye el reemplazo de toda la articulación tibiofemoral y la articulación patelofemoral. A partir de 2020, aproximadamente 1 millón de TKAs se realizan en los EE.UU. cada año14. Durante la TKA, un cirujano ortopédico resecta la parte superior de la meseta tibial y los cóndilos femorales inferiores(Figura 2A,2B)para ser equipado con implantes protésicos. A veces malinterpretado por los pacientes, en un TKA, solo se resejan 8-10 mm del extremo de cada hueso, que posteriormente se tapa o resurge, con metal. Un revestimiento de polietileno interpuesto forma la superficie del rodamiento (es decir, el acolchado) entre los dos implantes metálicos. Además, varios componentes de tejidos blandos de la articulación se extirpan total o parcialmente para lograr un equilibrio articular adecuado. Entre estos tejidos se encuentran los meniscos medial y lateral(Figura 2C),almohadilla de grasa infrapatelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E),sinovial(Figura 2F),y músculo oblicuo vasto medialis (VMO; Figura 2G) 15. Aunque los TKAs son generalmente exitosos para el tratamiento de la OA, alrededor del 20% de los pacientes reportan recurrencia del dolor después de la cirugía16. Junto con el alto costo y la relativa invasividad del procedimiento, estas limitaciones apuntan a la necesidad de más investigación para identificar tratamientos alternativos para mitigar la progresión de la OA.
Para explorar los mecanismos de la enfermedad en la OA que pueden presentar nuevas vías para la intervención terapéutica, se pueden utilizar sistemas experimentales, incluidas células, explantes de tejidos y modelos animales. Las células se cultivan típicamente en monocapa y se derivan de tejidos humanos o animales primarios (por ejemplo, condrocitos aislados del cartílago) o células inmortalizadas (por ejemplo, ATDC517 y CHON-00118). Si bien las células pueden ser útiles para manipular variables experimentales en un entorno de cultivo controlado, no capturan las condiciones de la articulación natural que se sabe que afectan los fenotipos celulares19. Para recapitular mejor la compleja cascada de comunicación química, mecánica y de célula a célula subyacente a la OA, se encuentra una alternativa en muestras primarias de tejido humano o animal, ya sea que se utilicen frescas o cultivadas ex vivo como explantes, para preservar la estructura del tejido y el microambiente celular20. Para estudiar la articulación in vivo,también son útiles los modelos animales pequeños (por ejemplo,ratón 21)y grandes (por ejemplo, caballo22)para OA (por ejemplo, a través de inducción quirúrgica, alteración genética o envejecimiento). Sin embargo, la traducción de estos modelos a la enfermedad humana puede estar limitada por diferencias anatómicas, fisiológicas y metabólicas, entre otras23. Teniendo en cuenta las ventajas y desventajas de los sistemas experimentales, las fortalezas clave de ser específico de la especie y mantener el nicho extracelular ofrecido por los tejidos primarios de OA humana maximizan el potencial de traducción de los hallazgos de la investigación.
Los tejidos primarios de OA humana se pueden obtener fácilmente después de la TKA, lo que hace que la alta frecuencia de TKA sea un recurso valioso para la investigación. Entre las posibles aplicaciones experimentales se encuentran la expresión génica y los análisis histológicos. Para darse cuenta del potencial de los tejidos primarios de OA humana para estos enfoques de investigación y otros, se describen las siguientes consideraciones clave. En primer lugar, el uso de muestras de pacientes está sujeto a regulación ética, y los protocolos deben cumplir con las aprobaciones de la Junta de Revisión Institucional (IRB)24. En segundo lugar, la heterogeneidad inherente de los tejidos primarios enfermos humanos y la influencia de variables como la edad y el sexo, entre otras, crean la necesidad de una cuidadosa selección del paciente (es decir, la aplicación de criterios de elegibilidad) y la interpretación de los datos. En tercer lugar, las propiedades biológicas únicas de diferentes tejidos en la articulación (por ejemplo, baja celularidad del cartílago y el menisco25)pueden presentar desafíos durante los experimentos (por ejemplo, aislar alta calidad y cantidad de ARN). Este informe aborda estas consideraciones y presenta un protocolo para la selección de pacientes, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (es decir, la evaluación de la pureza e integridad del ARN; Figura 3) fomentar el uso de tejidos primarios de OA humana en la comunidad investigadora.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4320-101</td>
			<td>Store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Chloroform (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19400290</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327272500</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Reagent Alcohol</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>C4305</td>
			<td>Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm sterile culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14 959 53A</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials (externally threaded)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10 500 26</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene (Falcon) tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12 565 271</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For RNA integrity measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Cutters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08 990</td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels (No.10)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120032</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15-576-028</td>
			<td>10% solution with dH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized with 70% EtOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue Coprecipitant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Reserved for RNA work only, store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td colspan="2">General lab equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For RNA purity and yield measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free/DEPC-treated water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Sterile)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20 012 050</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (2 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1000 &#181;L) &#38; tips</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma/Serum Advanced miRNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50 197 8158</td>
			<td>Sterile, nuclease-free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away/RNAseZap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td> 
			7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (semimicro size)</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td>Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Pro Scientific</td>
			<td>01-01200</td>
			<td>Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15 596 026</td>
			<td>Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection and rna extraction from the human osteoarthritic knee joint

La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular crónica y degenerativa que afecta con mayor frecuencia a la rodilla. Como actualmente no hay cura, la artroplastia total de rodilla (ATC) es una intervención quirúrgica común. Los experimentos con tejidos primarios de OA humana obtenidos de TKA proporcionan la capacidad de investigar los mecanismos de la enfermedad ex vivo. Si bien anteriormente se pensaba que la OA afectaba principalmente al cartílago, ahora se sabe que afecta a múltiples tejidos de la articulación. Este protocolo describe la selección del paciente, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (basado en la pureza, integridad y rendimiento del ARN) de cada uno de los siete tejidos únicos para apoyar la investigación del mecanismo de la enfermedad en la articulación de la rodilla. Con consentimiento informado, se obtuvieron muestras de pacientes sometidos a ATC para OA. Los tejidos se diseccionaron, lavaron y almacenaron dentro de las 4 h posteriores a la cirugía mediante congelación instantánea para la fijación de ARN o formalina para histología. Los tejidos recolectados incluyeron cartílago articular, hueso subcondral, menisco, almohadilla de grasa infrapatelar, ligamento cruzado anterior, sinovial y músculo oblicuo vasto medialis. Se probaron protocolos de extracción de ARN para cada tipo de tejido. La modificación más significativa involucró el método de desintegración utilizado para tejidos duros de células bajas, de matriz alta (considerados como cartílago, hueso y menisco) versus tejidos blandos de células relativamente altas, de matriz baja (considerados como almohadilla de grasa, ligamento, sinovial y músculo). Se encontró que la pulverización era apropiada para los tejidos duros, y la homogeneización era apropiada para los tejidos blandos. Se observó una proclividad de algunos sujetos a producir valores de número de integridad de ARN (RIN) más altos que otros sujetos consistentemente en múltiples tejidos, lo que sugiere que factores subyacentes como la gravedad de la enfermedad pueden afectar la calidad del ARN. La capacidad de aislar ARN de alta calidad de tejidos primarios de OA humana proporciona un modelo fisiológicamente relevante para experimentos sofisticados de expresión génica, incluida la secuenciación, que pueden conducir a conocimientos clínicos que se traducen más fácilmente a los pacientes.

Siete tejidos únicos de la articulación de la rodilla humana están disponibles para su recolección de pacientes sometidos a ATC para OA(Figura 1). En este protocolo, cada uno de estos tejidos fue identificado y procesado dentro de las 4 h de la extirpación quirúrgica (Figura 2). Siguiendo los pasos descritos en la Figura 3,las porciones de cada tejido se fijaron en formalina para la evaluación histológica<strong class="xfig"...

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Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Los tejidos primarios obtenidos de pacientes después de la artroplastia total de rodilla proporcionan un modelo experimental para la investigación de la osteoartritis con la máxima traducibilidad clínica. Este protocolo describe cómo identificar, procesar y aislar el ARN de siete tejidos únicos de la rodilla para apoyar la investigación mecanicista en la osteoartritis humana.

Recolección de tejidos y extracción de ARN de la articulación de la rodilla osteoartrítica humana

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Este protocolo fomenta el uso de tejidos humanos primarios como un modelo clínicamente relevante para la investigación de la osteoartritis. La realización de análisis histológicos y de expresión génica en estos tejidos puede proporcionar nuevos conocimientos mecanicistas. Esta técnica estandariza los métodos para la identificación y el procesamiento de los componentes de la articulación de la rodilla humana.Permite la extracción de ARN de alta calidad que cumple con los requisitos para los ensayos de expresión génica aguas abajo. Es difícil obtener ARN de alta calidad de los tejidos articulares enfermos, por lo que no se debe subestimar la importancia de pasos aparentemente insignificantes, como mantener todo limpio y fresco. Demostrando el procedimiento estarán Thomas Wilson, un investigador asociado y Navdeep Kaur, un becario postdoctoral de mi laboratorio.Comience por identificar los tejidos duros, incluidos el cartílago, el hueso y el menisco y los tejidos blandos, incluida la almohadilla de grasa infrapatelar, el ligamento cruzado anterior, la membrana sinovial y el músculo oblicuo vasto medialis de la muestra en función de las diferencias en el tamaño, la forma, el color y la textura. Corte cada uno de los tejidos en tres secciones. Enjuague las secciones de tejido con PBS estéril para eliminar cualquier residuo o desecho.Para la extracción de ARN, corte cada una de las tres secciones de tejido en cubos de aproximadamente uno a dos milímetros. Transfiera las piezas más pequeñas a un vial crio crio de dos mililitros. Después de asegurar las tapas herméticamente, congele los viales sumergiéndolos en nitrógeno líquido durante 30 segundos, luego transfiera el vial al congelador de menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo y repita este procedimiento para todos los tejidos.Homogeneizar el tejido duro utilizando un mortero y mortero. Antes de la homogeneización, enfríe el mortero, el mortero y la espátula con nitrógeno líquido para evitar que la muestra se descongele. Procese solo una muestra a la vez.Transfiera la muestra de tejido al mortero usando una espátula refrigerada. Vierta nitrógeno líquido sobre el tejido. Después de que el nitrógeno líquido se evapore, triture el tejido con un mortero.Agregue repetidamente nitrógeno líquido mientras muele el tejido para obtener polvo de tejido fino. Transfiera el polvo de tejido fino en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros pre-enfriado sumergiéndolo en nitrógeno líquido durante 30 segundos. Agregue un mililitro de la solución de ácido helado guanidinio fenol a cada tubo e incube los tubos en hielo durante 20 minutos.Antes de homogeneizar diferentes tejidos duros, limpie a fondo el mortero, el mortero y la espátula con etanol al 70%, luego con descontaminante RNasa, seguido de agua tratada con DEPC. Remoje el mortero, el mortero y la espátula en etanol al 70%, luego limpie cualquier líquido residual con un tejido limpio y sin pelusa. Homogeneizar el tejido blando utilizando el homogeneizador de tejidos.Para desinfectar el homogeneizador, lave la sonda haciendo correr tubos de etanol al 70% y descontaminante RNasa durante 30 segundos por lavado, luego lávese con agua tratada con DEPC, seguido de un 70% adicional de etanol, cada uno durante 30 segundos. Limpie cualquier líquido residual con un pañuelo limpio y sin pelusa. Agregue un mililitro de solución de ácido guanidinio fenol a los tubos inferiores redondos de cinco mililitros preetitiquetas y transfiera la muestra de tejido al tubo.Coloque el tubo sobre hielo durante todo el procedimiento y homogeneice el tejido durante un máximo de cinco pulsos 32, o hasta que el tejido se disuelva visualmente. Incubar el tejido homogeneizado en hielo hasta que se procesen todas las muestras de tejido. Desinfecte y limpie el homogeneizador antes de procesar la siguiente muestra de tejido.Usando forrceps estériles, retire cualquier trozo de tejido presente en los dientes de la sonda. Incube todo el tejido homogeneizado en el hielo durante 20 minutos adicionales y luego transfiera la muestra de tejido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado y preenfriado. Siete tejidos únicos de la articulación de la rodilla humana obtenidos de pacientes con osteoartritis se procesaron dentro de las cuatro horas posteriores a la extirpación quirúrgica.Los tejidos fueron identificados visualmente y confirmados por tinción histológica de H&E. Las secciones de tejido duro teñidas de H&E, el cartílago articular, el hueso subcondral y el menisco se visualizaron a seis veces el aumento y 40 veces el aumento. Del mismo modo, las secciones de tejidos blandos teñidas de H&E, la almohadilla de grasa infrapatelar, el ligamento cruzado anterior, la membrana sinovial y el músculo oblicuo vasto medialis se visualizaron a seis veces la ampliación y luego a 40 veces la ampliación.La evaluación de la calidad del ARN extraído indicó la presencia de muestras de alta calidad basadas en la integridad, el rendimiento y la pureza, así como muestras de baja calidad, lo que sugiere que, a pesar de utilizar un método optimizado, factores externos como la gravedad de la enfermedad pueden afectar la calidad del ARN en diferentes tejidos del mismo paciente. La identificación correcta de cada tipo de tejido es necesaria para permitir comparaciones intra e intersulares dentro y entre muestras de pacientes, especialmente dada la considerable heterogeneidad de los tejidos de la enfermedad primaria. Las tecnologías de secuenciación están evolucionando rápidamente, y el aislamiento de ARN de alta calidad es un requisito previo crítico para usar estas tecnologías para desentrañar los mecanismos subyacentes específicos del tejido en enfermedades complejas y crónicas como la osteoartritis.

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-disección de cerebro de rata para el ARN o la extracción de proteínas a partir de región específica del cerebro

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Investigación

Biología

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

La extracción de RNA a partir de células Neuroprecursor utilizando el kit de Bio-Rad ARN total

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Recolección, aislamiento y enriquecimiento de bacterias naturales magnetotácticas del Medio Ambiente

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extracción y análisis de cortisol de Derechos Humanos y de mono de pelo

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Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

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Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

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Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...