Denna metod gör det möjligt för oss att utvärdera rollen för perikardhålan som omger hjärtat och dess innehåll vid hjärtreparation efter hjärtinfarkt. Jämfört med konventionella koronar ligeringsmetoder för modellering av hjärtinfarkt, upprätthåller vår metod en intakt perikardhålighet, vilket möjliggör bestämning av innehåll och spårar deras roller efter hjärtischemisk skada. Att förstå bidraget från perikardhålan och hjärtats skaderespons kommer att ge viktiga insikter i terapeutiska strategier som riktar sig mot perikardiet för att förbättra hjärtläkning.
Till att börja med efter bedövning, begränsa musens tassar och placera den på operationsbordet. Efter att ha förberett musen för operation enligt beskrivningen i manuskriptet, ventilera musen med 2% isofluran och 100% syre som bärgas med hjälp av en kommersiell ventilator. Ställ sedan in en hastighet på 110 andetag per minut, en tidvattenvolym på 250 mikroliter och ett positivt utgångstryck på fyra millimeter kvicksilver.
Rulla musen 30% på höger sida för att placera bröstets vänstra sida för operation. Gör sedan ett två till tre centimeter lateralt snitt i brösthuden för att visualisera pectoralismusklerna på vänster sida. Gör ett snitt på en centimeter från mittlinjen utåt för att skära pectoralis major och minor.
Undvik överdriven blödning under hela cauterization av blödande kärl. Visualisera de interkostala musklerna mellan tredje och fjärde revbenen. Gör ett snitt på två centimeter i den vänstra interkostala muskeln för att införa luft i bröstkaviteten och låt hjärtat och lungorna falla bort från snittet.
För att skära interkostalen utan blödning, stoppa tillfälligt ventilatorn och expandera öppningen med en cautery-enhet. Använd retraktorer, dra tillbaka revbenen för att exponera hjärtat. Observera sedan perikardiet och det underliggande hjärtat under ett stereomikroskop.
Placera försiktigt pincetten på perikardiumytan för att minska perikardium och underliggande hjärtrörelser. Visuellt landmärke LAD kranskärl genom att spåra dess uppkomst under vänster bihang. Använd microneedle-drivrutinen och styr en lämplig sutur genom hjärtsäcken under LAD.
Observera suturen som dyker upp på andra sidan LAD och perikardiet. Representera den permanenta ligeringsmodellen, binda suturen för att begränsa blodflödet genom kranskärlen, vilket gör blanchering av den främre delen av vänster ventrikel synlig. Trimma sedan överskottet av sutur med hjälp av sax.
Ge underhållsinjektioner av smärtstillande subkutant var 12: e timme i 72 timmar efter operationen. Efter att ha minskat isofluranen till 1% stäng av isofluranen medan ventilationen bibehålls med syre. När djuret visar tecken på andning, ta bort det 23 gauge trakealröret från munnen och placera musen i en återhämtningsbur för att övervaka andningsåterupptagandet.
Låt musen återhämta sig i buret med en del av buret placerat på en värmedyna för att ge en extern värmekälla. Övervaka musens hälsotillstånd dagligen i sju dagar genom att utvärdera snitt och obehag hos djur. Administrera vid behov antibiotika för en framgångsrik återhämtning efter den invasiva operationen.
Efter att ha hållit musen under generell anestesi med syre, placera musen i en bakre position på en uppvärmd scenplattform och fäst tassarna på EKG-ledningarna. Skava sedan bröstet. Skaffa EKG-bilder med hjälp av givarsond och kontaktgel och analysera med lämplig programvara.
Efter icke-invasiv EKG-bedömning, stäng av isofluran och sätt tillbaka musen till buren. Fixa hjärtat i 10% formalin i minst 24 timmar. Skär provet med ett rakt rakblad genom höger kammare, interventrikulär septum och vänster ventrikel, så att snittet går genom mitten av infarktzonen.
Och sedan bäddar paraffin in vävnadsproverna. De skurna sektionerna placeras sedan i monteringskassett för ytterligare paraffininbäddning och efterföljande sektionering i fem mikrometer tjocka sektioner. Efter placering av vävnadssektioner på objektglas, deparaffinisera med toluen och graderad alkohol tvättar med avjoniserat vatten.
Rehydrera sedan. Färga sedan sektionen med 0,1% sirius röd i pikrinsyra i två timmar vid rumstemperatur. Tvätta sektionen med 0,5% ättiksyra i tre minuter följt av sköljning med 70% etanol i en minut.
Dehydrera sektionen med omvänd tvättordning med ökande och graderade etanolkoncentrationer innan de monteras för mikroskopisk utvärdering. Den framgångsrika hjärtinfarktinduktionen med den modifierade koronarligeringen bedömdes genom att undersöka hjärtats funktionella parametrar och strukturella egenskaper. För funktion bedömdes minskad ejektionsfraktion av vänster kammare genom ekokardiografi inom tre till fyra veckor efter hjärtinfarkt.
Den histologiska färgningen visade att de funktionella förändringarna åtföljdes av signifikant fibros i vänster ventrikelvägg, vilket ytterligare bekräftades genom kvantifiering av picrosirius rödfärgad fibros i hjärtats tvärsnitt vid fyra veckor efter infarkt med de störda eller intakta perikardiella koronarligeringsmodellerna. Att kombinera den fluorescerande pärlmärkningsmetoden med flödescytometrianalys gav ett tillvägagångssätt för att spåra de bosatta Gata6-positiva perikardiella makrofagerna. Det är viktigt att liten eller ingen märkning upptäcktes i hjärtat eller blodet.
Efter hjärtinfarkt kan cellernas omlokalisering spåras genom flödescytometri och avbildning. Kvantifiering av den fluorescerande pärlan märkt perikardiella myeloida celler med eller utan hjärtinfarkt visas. Försiktighet behövs för att förhindra att oavsiktligt störa eller riva det tunna perikardiet under proceduren.
Denna metod kan kombineras med härstamningsspårning av cellulära eller effektorblockad, vilket gör det möjligt att spåra och bestämma perikardialkomponentens inverkan på läkningssvaret i det infarkterade hjärtat. Vi har identifierat att perikardhålan skyddar hjärtat efter skada, som delvis förmedlas av bosatta perikardiella makrofager. Detta tillvägagångssätt öppnar ett nytt forskningsområde för hjärt-kärlsjukdom.