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November 20th, 2021
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November 20th, 2021
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मस्तिष्क वाक्यूलेचर धमनी, केशिकाओं और आरोही वेणुणों का एक जटिल नेटवर्क है। इन जहाजों को भित्ति कोशिकाओं द्वारा संलग्न किया जाता है, जैसे कि एनशिथिंग पेरिसाइट्स, जो अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन को व्यक्त करते हैं, और मर्मज्ञ धमनियों से पहले चार शाखाओं के भीतर पाए जाते हैं। हम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक RCaMP की अभिव्यक्ति के माध्यम से इन कोशिकाओं में कैल्शियम यात्रियों की कल्पना करने के लिए Acta2-RCaMP 1.07 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करते हैं।
कैल्शियम इन कोशिकाओं के संकुचन और रक्त प्रवाह नियंत्रण में एक मजबूत भूमिका निभाता है। केशिका पेरिसाइट्स संवहनी नेटवर्क में आगे डाउनस्ट्रीम पाए जाते हैं और अन्य ट्रांसजेनिक मॉडलों में लेबल किए जा सकते हैं। हालांकि, हम इस विधि में पेरिसाइट्स को एन्शिथिंग पर ध्यान केंद्रित करते हैं।
हमारे चूहों को शल्य चिकित्सा से एक पुरानी कपाल खिड़की के साथ प्रत्यारोपित किया गया है जो इमेजिंग के लिए मस्तिष्क वाक्यूलेचर तक पहुंच की अनुमति देता है। यहां, हम आवश्यक तैयारी चरणों और पूंछ नस इंजेक्शन की रूपरेखा तैयार करते हैं जिसके बाद दो फोटॉन इमेजिंग और विश्लेषणात्मक तरीकों से पेरिसाइट कैल्शियम डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में रक्त प्रवाह के बारे में जानकारी प्राप्त की जाती है। पूंछ नस कैथेटर इंजेक्शन के लिए निम्नलिखित वस्तुओं की आवश्यकता होती है: इंसुलिन सीरिंज, पीई10 ट्यूबिंग का 15 सेंटीमीटर टुकड़ा, 30 गेज सुई, धुंध, खारा, संदंश, हरी फ्लोरोसीन डेक्सट्रान डाई, चिमटा और कैंची।
हमारे पास केटामाइन जाइलाज़ीन संज्ञाहरण के साथ एक सुई भी है जिसे हम इमेजिंग से पहले इंजेक्ट करेंगे क्योंकि यह रक्त प्रवाह माप के लिए आइसोफलुरेन से बेहतर है। चिमटा का उपयोग करना, हब से एक 30 गेज सुई तोड़। ध्यान से एक खारा भरा सिरिंज से जुड़ी PE10 ट्यूबिंग के टुकड़े के अंत में सुई डालें।
यह इंजेक्शन के लिए कैथेटर है। आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें और आई-ल्यूब जेल लागू करें। पार्श्व नस को फैलाने के लिए पूंछ पर गर्म पानी के साथ एक दस्ताने क्षेत्र रखें।
इथेनॉल के साथ पूंछ की सफाई के बाद, सुई को नस में डालें और धीरे-धीरे कैथेटर के माध्यम से खारा इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सुई को सही ढंग से रखा गया है। फ्लोरोसिन डेक्सट्रान डाई से भरी सिरिंज के लिए कैथेटर पर सिरिंज स्विच करें। धीरे-धीरे डाई को इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई बुलबुले ट्यूब में प्रवेश न करें।
डेक्सट्रान सिरिंज को नमकीन सिरिंज से बदलें और ट्यूब में कोई डाई न छूटने तक टयूबिंग को कुल्ला करें। सुई निकालें और धुंध के साथ दबाएं। इमेजिंग के लिए केटामाइन जाइलाज़ीन एनेस्थीसिया इंजेक्ट करें।
माउस सिर के साथ एक हीटिंग पैड पर तय, दंत एप्लीकेटर के साथ कपाल खिड़की को साफ करें। खिड़की पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें और दो फोटॉन माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से ध्यान केंद्रित करें। दो फोटॉन इमेजिंग के लिए, हम उत्सर्जन का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट, उत्तेजन और फोटोमिल्टीप्लायर ट्यूब के लिए ट्यूनेबल टाइटेनियम नीलमणि लेजर के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में, आरसीएएमपी और फ्लोरोसेइन डेक्सट्रान दोनों को उत्तेजित करने के लिए तरंगदैर्ध्य को 990 नैनोमीटर सेट करें। इसके बाद पोकेल सेल वोल्टेज और पीएमटी डिटेक्टर सेंसिटिविटी को एडजस्ट कर लेजर पावर सेट करें। इन मापदंडों और उच्च संकल्प के साथ लाइव स्कैनिंग, RCaMP सकारात्मक भित्ति कोशिकाओं और फ्लोरोसेंटी लेबल रक्त प्लाज्मा देखा जा सकता है ।
संवहनी नेटवर्क में पेरिसाइट्स का ठीक से पता लगाने के लिए गहराई के ढेर के अधिग्रहण की सिफारिश की जाती है। पीओ जहाजों के पास ऊतक के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करते समय, इसे शून्य बिंदु और जेड श्रृंखला स्टैक के शीर्ष के रूप में सेट करें, फिर ऊतक में वांछित गहराई तक ध्यान केंद्रित करें और इसे स्टैक के नीचे के रूप में सेट करें। लेजर शक्ति को बढ़ाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए क्योंकि माइक्रोस्कोप स्टैक के माध्यम से गहरा चलता है।
छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में जेड श्रृंखला खोलना, दो चैनलों को रंगीन छवियों के रूप में मर्ज करें और पेरिसाइट्स और ब्याज की रक्त वाहिकाओं के लिए स्टैक के माध्यम से स्कैन करें। ब्याज के उन क्षेत्रों का चयन करें जिनमें पेरिसाइट्स होते हैं और भविष्य के इमेजिंग सत्रों में इन स्थानों का पता लगाने में मदद करने के लिए पदों को बचाते हैं। एक पेरिसाइट कैल्शियम इवेंट को इकट्ठा करने और स्थानांतरित करने के लिए, अधिग्रहण फ्रेम दर को प्रति सेकंड 10 फ्रेम से अधिक बढ़ाएं।
इमेजिंग अवधि को 60 सेकंड तक सेट करें और एक अद्वितीय फ़ाइल नाम के साथ सेव पथ को अपडेट करें। कम संकल्प के लिए खाते के लिए और pericyte के करीब देखने के लिए पोत पर ऑप्टिकली ज़ूम करें। टी सीरीज हासिल करें।
रक्त वाहिका व्यास और लाल रक्त कोशिका वेग को मापने के लिए, माइक्रोस्कोप के साथ एक आयामी स्कैन शुरू करने के लिए लाइन स्कैन का चयन करें। सबसे पहले मिलीसेकंड में स्कैन की अवधि निर्धारित करें। फिर एक रेखा खींचें जो ब्याज के पोत को विभाजित करती है और पोत के साथ समानांतर चलती है।
इससे दाईं ओर पोत के माध्यम से चलने वाली लाल रक्त कोशिकाओं के बाईं ओर पोत व्यास का एक कायनोग्राफ उत्पन्न होगा। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों और पैकेजों की पूरी सूची के लिए सामग्री तालिका देखें। पहले छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में हाथ से ब्याज के क्षेत्रों का चयन करें।
टी श्रृंखला फ़ाइल लोड, ढेर का औसत ले, और एक रंगीन छवि बनाते हैं। बहुभुज उपकरण का चयन करें और सोमा और प्रक्रियाओं जैसे दृश्यमान एनशिथिंग पेरिसाइट संरचनाओं को रेखांकित करें। ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र को एक अनूठा नाम दें और उन्हें एक ज़िप फ़ोल्डर के रूप में सहेजें जिसे बाद में प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में लोड किया जा सकता है।
प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर खोलें और सुनिश्चित करें कि छवि प्रसंस्करण पैकेज के लिए फ़ोल्डर पथ पर हैं। प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में कैल्शियम टी श्रृंखला आयात और परिभाषित क्या प्रत्येक चैनल पर है। इस मामले में, यह चैनल एक पर एक सेलुलर सिग्नल और चैनल दो पर रक्त प्लाज्मा है।
विज़ुअलाइज़ेशन को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर के भीतर डेटा को एक फिल्म के रूप में प्लॉट करें। फ्लोरोसिन डेक्सट्रान से हरे फ्लोरोसेंट को हटाने के लिए जो लाल आरसीएएमपी चैनल में ब्लीडिंग करता है, छवि प्रसंस्करण पैकेज में चैनलों को अन-मिक्स करता है। सबसे पहले एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जिसमें केवल फ्लोरोफोर 1, इस मामले में आरसीएएमपी शामिल हो।
दूसरा एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जिसमें केवल फ्लोरोफोर 2, प्लाज्मा में फ्लोरोसीन होता है। अंत में एक पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन करें जिसमें फ्लोरोफोर नहीं है। यह एक स्पेक्ट्रल योगदान मैट्रिक्स उत्पन्न करता है, जो प्रत्येक चैनल में प्रत्येक पिक्सेल पर लागू होता है।
यह आरसीएएमपी सिग्नल के स्थानीयकरण में काफी सुधार करता है, जो इन संरचनाओं में कैल्शियम की घटनाओं का पता लगाने में वृद्धि करेगा। कई तरीके हैं कि कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण इमेज प्रोसेसिंग पैकेज के भीतर किया जा सकता है। सबसे पहले अमिश्रित कैल्शियम फिल्म पर सेलुलर सिग्नलिंग विश्लेषण चलाएं और ज़िप फ़ोल्डर से ब्याज के क्षेत्रों को लोड करें जो पहले हाथ से पेरिसाइट्स से चुने गए थे।
स्केल फैक्टर को एक में सेट करें क्योंकि क्षेत्रों को आकार देने की आवश्यकता नहीं है। प्रसंस्करण के बाद, प्रत्येक रॉय के भूखंड और विभिन्न रंगों में सामान्यीकृत कैल्शियम के निशान उत्पन्न करें। यदि कोड व्यक्तिगत निशान में कैल्शियम की अधिकांश घटनाओं का पता नहीं लगाता है, तो अनुकूलन बॉक्स के भीतर अंतर्निहित मापदंडों को संशोधित करें, जैसे कि छोटे पास फ़िल्टर किए गए डेटा के लिए सीमा को बेसलाइन अवधि के मानक विचलन से तीन गुना तक कम करना, जो टी श्रृंखला के पहले 30 फ्रेम हैं।
संकेतों का पता लगाने और वर्गीकृत करने के लिए, सामान्यीकृत कैल्शियम ट्रेस लंबे पास और बैंड पास फ़िल्टर किया जाता है, जो आयाम और अनुमानों के साथ डेटा को सुचारू करने में मदद करता है, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए कि सिग्नल एकल चोटियों, बहु चोटियों या पठार हैं या नहीं। आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सीएसवी फ़ाइल के रूप में डेटा आउटपुट करें। सेलुलर सिग्नलिंग विश्लेषण को अनमिक्स कैल्शियम फिल्म पर दूसरी बार चलाएं और तीन आयामों, एक्स, वाई और समय में फ्लोरोसेंट में गतिविधि और परिवर्तन के आधार पर ब्याज पहचान के स्वचालित क्षेत्र का चयन करें।
रुचि के पहचाने गए क्षेत्रों को देखने के लिए प्रक्रिया परिणामों को प्लॉट करना अलग-अलग रंग है। यदि एल्गोरिदम आरओवाई का पता नहीं लगाता है जो फिल्म में आंखों से स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, तो अंतर्निहित मापदंडों को संशोधित करें, जैसे कि गॉसियन फ़िल्टर को बढ़ाना जो डेटा को समय में चिकना करता है और आरओवाई को बेसलाइन के मानक विचलन से तीन गुना तक खोजने की सीमा को कम करता है। आगे के दृश्य के लिए एक फिल्म के रूप में ROYs प्लॉट ।
आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सीएसवी फ़ाइल के रूप में डेटा आउटपुट करें। लाइन स्कैन kymograph डेटा प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में फ़ाइल आयात और परिभाषित क्या प्रत्येक चैनल पर है । लाइन स्कैन पर व्यास विश्लेषण फ़ंक्शन चलाएं, जो उस क्षेत्र का चयन करने के लिए एक बॉक्स खोलता है जो किग्राफ में व्यास से मेल खाता है।
कामोग्राफ फ्लोरोसेंट की सीमाओं के बाहर एक बॉक्स ड्रा करें, जो पोत व्यास से मेल खाती है। पोत व्यास के लिए आधी अधिकतमा पर पूर्ण चौड़ाई को मापने और एक साजिश उत्पन्न करने के लिए इस डेटा वर्ग को संसाधित करें। इसके बाद परिवर्तन विश्लेषण पर वेग दर को चलाएं और कामोग्राफ फ्लोरोसेंट की सीमा के अंदर एक बॉक्स आकर्षित करें।
लाल रक्त कोशिकाओं के वेग, प्रवाह और रैखिक घनत्व की गणना करने के लिए इस डेटा वर्ग को संसाधित करें। आगे के विश्लेषण के लिए सीएसवी फ़ाइल के रूप में रक्त प्रवाह के परिणामों को आउटपुट करें। हाथ से सेलुलर संरचनाओं का चयन इन क्षेत्रों के भीतर कैल्शियम के उतार-चढ़ाव का पता लगाने की अनुमति देता है, जिसमें विभिन्न प्रकार के सिग्नल चोटियां शामिल हैं, जैसे कि एकल चोटियों और बहु चोटियों, सामान्यीकृत कैल्शियम के निशान कम पास और बैंड पास फ़िल्टर किए जाने के बाद।
इसके अतिरिक्त, सक्रिय पिक्सेल को एक साथ समूहित करके रुचि के क्षेत्रों की पहचान की जाती है जहां इमेज प्रोसेसिंग एल्गोरिदम का उपयोग करके समय के साथ फ्लोरोसेंट की तीव्रता बदलती है। यह संकेत के अपेक्षित आकार और आकार को शामिल करने के लिए समय, सीमा और स्थानिक मापदंडों को समायोजित करके किसी भी गतिशील सेलुलर सिग्नल पर लागू किया जा सकता है। सिग्नल पहचान के लिए सीमा कम करने से ब्याज के अधिक क्षेत्र मिलते हैं ।
स्पष्ट, हेमोडायनामिक केमोग्राफ का विश्लेषण किया जाता है ताकि रक्त वाहिकाओं में व्यास और लाल रक्त कोशिका वेग को मापने के लिए हृदयाय के पास किया जा सके। व्यास की गणना पूर्ण चौड़ाई से फ्लोरोसेंट की आधी अधिकतम पर की जाती है। लाल रक्त कोशिका वेग अवेलेबल लाल रक्त कोशिकाओं से बने धारियों से अनुमानित होता है, जहां कोण वेग की गणना करने के लिए एक राडॉन परिवर्तन में इनपुट होता है।
खराब गुणवत्ता वाले किमोग्राफ, जहां फ्लोरोसेंट संतृप्ति, शोर अनुपात के लिए खराब संकेत, या इमेजिंग क्षेत्र की आवाजाही होती है, त्रुटि बिंदुओं के साथ अविश्वसनीय भूखंड बनाता है, जो रेड क्रॉस के रूप में इंगित होता है, जहां डेटा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। अधिग्रहीत डेटा की गुणवत्ता एक अच्छे परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का पालन अच्छे परिणाम सुनिश्चित करता है। इस वीडियो में, हम दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मस्तिष्क एन्सेथिंग पेरिसाइट्स और रक्त प्रवाह माप के संयुक्त कैल्शियम इमेजिंग के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करते हैं।
ये तकनीक मस्तिष्क संवहनी नेटवर्क के भीतर भित्ति कोशिका शरीर विज्ञान और स्थानीयकरण के बारे में सवालों को संबोधित करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन उन्हें मस्तिष्क या अन्य अंग प्रणाली में किसी भी कोशिका प्रकार में कैल्शियम यात्रियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल एनेस्थेटाइज्ड चूहों में पास के रक्त वाहिकाओं से मस्तिष्क एनेस्थिंग पेरिसाइट्स और रक्त प्रवाह डेटा से फ्लोरोसेंट कैल्शियम छवियों को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कदम प्रस्तुत करता है। ये तकनीक भित्ति कोशिका शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं और किसी भी कोशिका प्रकार में कैल्शियम यात्रियों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
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