3.2K Views
•
14:22 min
•
November 20th, 2021
DOI :
November 20th, 2021
•Transcript
Hjernevaskulaturen er et komplekst nettverk av gjennomtrengende arterier, kapillærer og stigende venuler. Disse karene er innkapslet av veggmalericeller, for eksempel ensheathing pericytes, som uttrykker alfa glatt muskel aktin, og finnes i de fire første grenene fra gjennomtrengende arterier. Vi bruker Acta2-RCaMP 1,07 transgene mus, for å visualisere kalsiumtransienter i disse cellene, gjennom uttrykk for den genetisk kodede kalsiumindikatoren RCaMP.
Kalsium spiller en sterk rolle i sammentrekning av disse cellene og blodstrømskontroll. Kapillære pericytter finnes lenger nedstrøms i det vaskulære nettverket og kan merkes i andre transgene modeller. Vi fokuserer imidlertid på å ensheathing pericytes i denne metoden.
Musene våre har blitt kirurgisk implantert med et kronisk kranialvindu som gir tilgang til hjernens vaskulatur for avbildning. Her skisserer vi de nødvendige forberedelsestrinnene og haleveneinjeksjonen etterfulgt av de to fotonavbildnings- og analysemetodene som trengs for å skaffe pericyte kalsiumdata og informasjon om blodstrøm hos bedøvede dyr. Følgende elementer er nødvendige for en hale venekateter injeksjon: insulin sprøyter, et 15 centimeter stykke PE10 rør, 30 gauge nåler, gasbind, saltvann, tang, grønn fluorescein dextran fargestoff, tang og saks.
Vi har også en nål med ketamin Xylazine anestesi som vi vil injisere før avbildning som det er bedre enn isofluran for blodstrømsmålinger. Bruk tangene til å bryte en 30 gauge nål fra navet. Sett kanylen forsiktig inn i enden av PE10-slangen som er festet til en saltvannsfylt sprøyte.
Dette er kateteret for injeksjon. Bedøv en mus med isofluran og påfør I-Lube gel. Plasser et hanskefelt med varmt vann på halen for å utvide sidevenen.
Etter rengjøring av halen med etanol, sett nålen inn i venen og injiser saltvann forsiktig gjennom kateteret for å sikre at nålen er riktig plassert. Slå sprøyten på kateteret for en sprøyte fylt med fluorescein dekstran fargestoff. Injiser fargestoffet langsomt for å sikre at ingen bobler kommer inn i røret.
Skift ut dekstransprøyten med saltvannssprøyten og skyll slangen til det ikke er noe fargestoff igjen i røret. Fjern nålen og trykk med gasbind. Injiser ketamin Xylazine anestesi for avbildning.
Når musehodet er festet på en varmepute, rengjør kranialvinduet med tannapplikatorer. Påfør ultralydgel på vinduet og fokuser gjennom de to fotonmikroskopmålet. For to fotonavbildninger bruker vi et mikroskop med justerbar titan Sapphire-laser for fluorescerende, eksitasjon og fotomultiplikatorrør for utslippsdeteksjon.
I mikroskopprogramvaren setter du bølgelengden til 990 nanometer for å begeistre både RCaMP og fluorescein dextran. Still deretter inn lasereffekten ved å justere pockelcellespenningen og PMT-detektorens følsomhet. Live skanning med disse parametrene og høyere oppløsning, RCaMP positive veggmalericeller og det fluorescerende merkede blodplasmaet kan sees.
Oppkjøp av en dybdestabel anbefales å finne pericytter riktig i det vaskulære nettverket. Når du fokuserer på toppen av vevet nær PO-fartøyene, sett dette som nullpunkt og toppen av Zed-seriestakken, fokuser deretter ned i vevet til ønsket dybde og sett dette som bunnen av stabelen. Lasereffekten må justeres for å øke etter hvert som mikroskopet beveger seg dypere gjennom stabelen.
Åpne Zed-serien i bildebehandlingsprogramvare, slå sammen de to kanalene som fargede bilder og skann gjennom bunken for pericytter og blodkar av interesse. Velg interesseområder som inneholder pericytter, og lagre posisjonene for å hjelpe deg med å finne disse stedene igjen i fremtidige bildebehandlingsøkter. For å samle og flytte en pericyte kalsiumhendelse, øk oppkjøpsrammen til mer enn 10 bilder per sekund.
Angi bildebehandlingsvarigheten til 60 sekunder, og oppdater lagringsbanen med et unikt filnavn. Zoom optisk på fartøyet for å ta høyde for lavere oppløsning og for å få en nærmere oversikt over pericytten. Skaff deg T-serien.
For å måle blodkardiameter og rød blodcellehastighet, velg linjeskanning for å starte en endimensjonal skanning med mikroskopet. Angi først varigheten for skanningen i millisekunder. Tegn deretter en linje som krysser fartøyet av interesse og beveger seg parallelt langs fartøyet.
Dette vil generere en kymografi av kardiameteren til venstre og striper av de røde blodcellene som beveger seg gjennom fartøyet til høyre. Se materialtabellen for en fullstendig liste over programmer og pakker som brukes i denne protokollen. Velg først interesseområder for hånd i programvare for bildebehandling.
Last inn T-seriefilen, ta gjennomsnittet av stabelen og lag et farget bilde. Velg mangekantverktøyet, og omriss de synlige omsluttende pericytstrukturene, for eksempel soma og prosesser. Gi hvert interesseområde et unikt navn, og lagre dem som en zip-mappe som kan lastes inn senere i programmeringsprogramvaren.
Åpne programmeringsprogramvaren, og kontroller at mappene for bildebehandlingspakkene er på banen. Importer kalsium T-serien til programmeringsprogramvaren og definer hva som er på hver kanal. I dette tilfellet er det et mobilsignal på kanal en og blodplasma på kanal to.
Plott dataene som en film i programmeringsprogramvaren for å lette visualiseringen. For å fjerne grønne fluorescerende fra fluorescein dextran som blør gjennom i den røde RCaMP-kanalen, fjern blandingen av kanalene i bildebehandlingspakken. Velg først en region som bare inneholder fluorofor 1, RCaMP i dette tilfellet.
Andre velger en region som bare inneholder fluorofor 2, fluorescein i plasma. Til slutt velger du et bakgrunnsområde som ikke har verken fluorofor. Dette genererer en spektral bidragsmatrise, som brukes på hver piksel i hver kanal.
Det forbedrer lokaliseringen av RCaMP-signalet betydelig, noe som vil forbedre påvisning av kalsiumhendelser i disse strukturene. Det er flere måter kalsiumavbildningsdataene kan analyseres i bildebehandlingspakkene. Kjør først den cellulære signalanalysen på den umiksede kalsiumfilmen og last inn interesseområdene fra zip-mappen som ble valgt fra pericyttene for hånd tidligere.
Sett skaleringsfaktoren til en fordi områdene ikke trenger å endre størrelse. Etter behandling, generer tomter av hver ROY og de normaliserte kalsiumsporene i forskjellige farger. Hvis koden ikke oppdager de fleste kalsiumhendelser i de enkelte sporene, endrer du de innebygde parametrene i optimaliseringsboksen, for eksempel å redusere terskelen for kortpassfiltrerede data til tre ganger standardavviket for basisperioden, som er de første 30 rammene i T-serien.
For å oppdage og klassifisere signalene er det normaliserte kalsiumsporet langpass og båndpass filtrert, noe som bidrar til å glatte dataene for amplitude og med beregninger, men også for å avgjøre om signaler er enkelttopper, multitopper eller platåer. Send ut dataene som en CSV-fil for videre statistisk analyse. Kjør den cellulære signalanalysen en gang til på den umiksede kalsiumfilmen og velg det automatiserte området av interesseidentifikasjon basert på aktiviteten og endringen i fluorescerende midler i tre dimensjoner, X, Y og tid.
Plott prosessresultatene for å vise de identifiserte interesseområdene er forskjellige farger. Hvis algoritmen ikke oppdager avkastningstegn som er tydelig synlige for øyet i filmen, endrer du de innebygde parameterne, for eksempel å øke det gaussiske filteret som jevner ut dataene i tide og reduserer terskelen for å finne avkastningskontroll til tre ganger standardavviket for grunnlinjen. Plotter roys som en film for videre visualisering.
Send ut dataene som en CSV-fil for videre statistisk analyse. Importer datafilen for linjeskanning kymografi til programmeringsprogramvaren og definer hva som er på hver kanal. Kjør diameteranalysefunksjonen på linjeskanningen, som åpner en boks for å velge området som tilsvarer diameteren i kymografen.
Tegn en boks utenfor kymografiens fluorescerende grenser, som tilsvarer kardiameteren. Behandle denne dataklassen for å måle hele bredden ved halv maksimala for kardiameter og generere en tomt. Deretter kjører hastigheten på transformasjonsanalyse og tegner en boks innenfor grensen til kymografifluorescerende.
Behandle denne dataklassen for å beregne hastigheten, fluksen og den lineære tettheten til røde blodlegemer. Send ut blodstrømsresultatene som en CSV-fil for videre analyse. Valg av cellulære strukturer for hånd tillater deteksjon av kalsiumsvingninger i disse regionene, inkludert forskjellige typer signaltopper, for eksempel enkelttopper og flere topper, etter at de normaliserte kalsiumsporene er lavpass og båndpass filtrert.
I tillegg identifiseres interesseområder ved å gruppere aktive piksler sammen der lysstoffrørenes intensitet endres over tid ved hjelp av bildebehandlingsalgoritmer. Dette kan brukes på et hvilket som helst dynamisk mobilsignal ved å justere tids-, terskel- og romlige parametere for å omfatte signalets forventede størrelse og form. Hvis terskelen for signalidentifikasjon reduseres, finner du flere interesseområder.
Klare, hemodynamiske kymografer analyseres for å måle diameter og rød blodcellehastighet i blodkar nær ensheathing pericytter. Diameteren beregnes fra full bredde ved halvparten maksimum av fluorescerende. Den røde blodcellehastigheten er tilnærmet fra stripene laget av umerkede røde blodlegemer, hvor vinkelen legges inn i en radontransformasjon for å beregne hastigheten.
Kymografer av dårlig kvalitet, der det er fluorescerende metning, dårlig signal-til-støy-forhold eller bevegelse av bildefeltet, skaper upålitelige tomter med feilpunkter, angitt som røde kryss, der data ikke kan bestemmes. Kvaliteten på de innsamvede dataene er avgjørende for et godt resultat, og å følge trinnene som er beskrevet i denne protokollen sikrer gode resultater. I denne videoen skisserer vi prosedyren for kombinert kalsiumavbildning av hjerneomsluttende pericytter og blodstrømsmålinger ved to fotonmikroskopi.
Disse teknikkene er nyttige for å ta opp spørsmål om veggmalericellefysiologi og lokalisering i hjernens vaskulære nettverk, men de kan tilpasses for å studere kalsiumtransienter i enhver celletype i hjernen eller et annet organsystem.
Denne protokollen presenterer trinn for å skaffe og analysere fluorescerende kalsiumbilder fra hjernen som omkranser pericytter og blodstrømsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Disse teknikkene er nyttige for studier av veggmalericellefysiologi og kan tilpasses for å undersøke kalsiumtransienter i enhver celletype.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved