Name: establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons at JoVE

Este manuscrito foi apoiado pelo seguinte: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Prêmio de Desenvolvimento de Carreira de Cientista Clínico (CWH) da Doris Duke Charitable Foundation. 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Agradecemos ao Dr. Raha Dastgheyb e ao Dr. Norman Haughey por fornecerem a plataforma MEA e o software de análise de dados que utilizamos para validar a plataforma eletrofisiológica descrita. Gostaríamos de agradecer a Khalil Rust por sua assistência com a demonstração do protocolo e filmagem.

1. Preparação do meio de cultura celular
<ol><li>Preparar os meios de cultura celular individuais utilizando as composições mencionadas na Tabela 1.</li>
	<li>Misture e filtre o meio estéril em frascos filtrados de 500 mL e armazene protegido da luz a 4 °C por até 2 semanas.</li>
</ol>2. Manutenção e passagem de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos não confluentes (hiPSC)
<ol><li>Descongelar a matriz da membrana basal (armazenada em alíquotas a -80 °...

<ol>
	<li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets.">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).</li><li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system.">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li><li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks.">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology.">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li><li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li><li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons.">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li><li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+astrocytes:+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders.">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li><li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes.">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li><li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system.">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment.">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li><li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes.">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li><li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1/S+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo.">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses.">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li></ol>

Até o momento, métodos baseados em hiPSC e MEA para registros eletrofisiológicos de coculturas de astrócitos-neurônios encontraram aplicação limitada no campo da ELA6 e ainda não em plataformas totalmente humanas, em contraste com seu uso mais difundido para modelagem in vitro da epilepsia9. Esta plataforma, no entanto, tem o potencial de abordar questões patofisiologicamente relevantes na pesquisa da ELA, como os mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal...

Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) são ferramentas poderosas para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) in vitro e fornecem um paradigma translacional para estratégias de descoberta de medicamentos1. Pesquisadores demonstraram que a cocultura de hiPSC-A com hiPSC-N aumenta a maturação morfológica, molecular, eletrofisiológica e farmacológica de ambos os tipos celulares, gerando redes neuronais complexas e interações astrócitos-neurônios que se assemelham às suas contrapartes in vivo 2,3. Experimentos de cocultura semelhantes podem recapitular características da patobiologia da ELA, como neurotoxicidade mediada por astrócitos 4,5 e hiperexcitabilidade neuronal6. Além disso, com os avanços nos protocolos de diferenciação, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) podem ser diferenciadas em subtipos neurais regionalmente específicos, incluindo hiPSC-A cortical e medular e hiPSC-N 7,8. Essas estratégias fornecem o potencial para modelar a patologia do neurônio motor cortical e espinhal na ELA, bem como a influência astrocítica em ambos. No entanto, isso requer que haja um ensaio funcional reprodutível para determinar esses efeitos.
Recentemente, demonstrou-se que o registro de multieletrodos (MEA) é particularmente adequado para a caracterização eletrofisiológica de coculturas neurônio-astrócitos2. Ao contrário das análises eletrofisiológicas de célula única, essas matrizes de eletrodos de alta densidade registram passivamente os potenciais de campo extracelular de grandes populações de neurônios sem interromper as condições de cultura e preservar a integridade das membranas celulares. Essas plataformas são particularmente úteis para registrar a atividade celular e de rede das culturas ao longo do tempo e em resposta à manipulação farmacológica. Finalmente, quando a presença de astrócitos é uma variável de cultura, os registros de MEA podem fornecer insights funcionais sobre as interações bidirecionais astrócitos-neurônios 2,9.
Apresenta-se aqui um protocolo otimizado para a diferenciação de hiPSC em hiPSC-A da medula espinhal e neurônios motores hiPSC (MN) previamente validado2. O protocolo de diferenciação hiPSC-A da medula espinhal resulta consistentemente em culturas de astrócitos, que são positivas para a proteína B de ligação ao cálcio S100 (S100β), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e Homeobox B4 (HOXB4) em até 80%, 50% e 90% das células, respectivamente, indicando uma especificação de maturação da glial e da medula espinhal 2,10 . O protocolo de diferenciação hiPSC-MN gera neurônios >90% positivos para a acetiltransferase de colina (ChAT), sugestivos de uma identidade de neurônio alfa-motor maduro2. Além disso, o protocolo descreve técnicas para a geração de coculturas hiPSC-A/MN previamente demonstradas como resultando em neurônios com maior complexidade morfológica pela análise de Scholl e microscopia imunofluorescente quando comparadas a culturas neuronais sem astrócitos ou com astrócitos de roedores2. Embora essas descrições sejam específicas para hiPSC-A e hiPSC-N da medula espinhal, uma vantagem única é que a cultura independente inicial de astrócitos e neurônios, seguida de etapas para co-cultura em momentos posteriores, pode ser traduzida para estudar os efeitos das interações neurônio-astrócitos de outras regiões específicas, bem como células específicas da doença 7,8 . Finalmente, o protocolo descreve como cultivar essas culturas em placas MEA para que a atividade funcional como fator de composição da cocultura possa ser estudada ao longo do tempo com a capacidade de manipular a composição celular, bem como as condições de cultura.
O objetivo desses protocolos é fornecer um ensaio funcional para investigar as interações astrócitos-neurônios, examinar alterações específicas da doença e testar drogas com potencial terapêutico no campo da ELA. Instruções em vídeo são fornecidas para as etapas mais desafiadoras deste protocolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 sterile culture flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 110 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.2 &#181;m CA Filter System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well sterile culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericine B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Working concentration 2.0 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273287</td>
			<td>Working concentration 1% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (ASAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 &#181;m filter, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)</td>
			<td>Axion</td>
			<td>OPT-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion Edge MEA platform</td>
			<td>Axion</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane matrix - Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Details in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415510-1100-000</td>
			<td>Primo Vert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14340</td>
			<td>Working concentration10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tanks and regulator for Axion Edge</td>
			<td>AirGas/Harris</td>
			<td>9296NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142164</td>
			<td>Dissolve 250 &#181;g in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 &#181;M stock. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanquixaline&#160; (CNQX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrokainic acid (DHK)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>111</td>
			<td>Working concentration 50 &#956;M and 300 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>113300</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Combine 10 mL of Essential 8 (10x)&#160; supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Dissolve 100 &#181;g in 1mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Election Microscopy Sciences</td>
			<td>63510-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 &#181;L tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 &#181;g/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity controlled Cell culture incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>370</td>
			<td>set to 37 &#186;C, 5 % CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td>Dissolve 200 &#181;g in 2 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 &#181;g/mL stock and store at -80 &#186;C. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 10 &#181;g/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainc acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab144490</td>
			<td>Working concentration 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10828</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 &#181;g/mL (coating), 1 &#181;g/mL (cell media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Dissolve 2 mg of LDN into 500 &#181;L of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 &#186;C. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 &#181;M working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25030</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA glass plates</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PJ22224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 &#181;L tubes. (working concentration 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Working concentration100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMN)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>540223</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 &#181;g in 1 mL of PBS to 100 &#181;g/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 &#181;g/mL. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 &#181;L/tube and freeze at -80 &#186;C. Take 200 &#181;L of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 &#181;L/tube&#160;and store at -80 &#186;C. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK-I nhibitor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>1293823</td>
			<td>Dissolve 5 mg in 1480 &#181;L of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 &#181;M).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 &#186;C. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hoods</td>
			<td>Baker Company</td>
			<td>SG-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement B - B27 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Working concentration 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement N - N2 Supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Working concentration 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top cell culture centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004261</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic&#160;film - Parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue dissociation protease - Dispase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 &#186;C. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2530054</td>
			<td>Working concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2332</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an electrophysiological platform for modeling als with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons

Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) fornecem uma ferramenta poderosa para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica ( ELA) in vitro. As gravações de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) são um meio de registrar potenciais de campo elétrico de grandes populações de neurônios e analisar a atividade da rede ao longo do tempo. Foi demonstrado anteriormente que a presença de hiPSC-A que são diferenciados usando técnicas para promover um fenótipo de astrócitos da medula espinhal melhorou a maturação e a atividade eletrofisiológica dos neurônios hiPSC-motores (MN) da medula espinhal regionalmente específicos quando comparados àqueles cultivados sem hiPSC-A ou na presença de astrócitos de roedores. Descrito aqui é um método para co-cultura de hiPSC-A da medula espinhal com hiPSC-MN e registrar a atividade eletrofisiológica usando registros de MEA. Embora os protocolos de diferenciação descritos aqui sejam específicos de astrócitos e neurônios que são regionalmente específicos da medula espinhal, a plataforma de co-cultura pode ser aplicada a astrócitos e neurônios diferenciados com técnicas específicas para outros destinos, incluindo hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Esses protocolos visam fornecer um ensaio eletrofisiológico para informar sobre as interações glia-neurônio e fornecer uma plataforma para testar drogas com potencial terapêutico na ELA.

O protocolo de padronização da medula espinhal para a geração de hiPSC-MN e hiPSC-A da medula espinhal está descrito na Figura 1. Nesse protocolo, as hiPSCs são mantidas e passadas como colônias não confluentes (Figura 2A). A neurogênese é iniciada (indução neural) através da inibição dupla do SMAD pela adição de LDN193189 e SB431542, inativando as vias da proteína morfogenética óssea (BMP) e do fator de crescimento transformador-beta (TGF-β...

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Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

A técnica que apresentamos hoje permite a análise da atividade dos neurônios da medula espinhal como resultado do fator neuronal intrínseco e da influência dos astrócitos circundantes. Esta técnica gera de forma confiável neurônios humanos e astrócitos humanos que são específicos da medula espinhal e usa uma medida de saída funcional que pode ser dimensionada para reprodutibilidade. A técnica que apresentamos permite investigar doenças específicas dos neurônios da medula espinhal, como a esclerose lateral amiotrófica, usando neurônios de pacientes com doença esporádica ou genética.Para começar, examine as placas iPSC humanas em busca de colônias suficientemente densas, de modo que o centro das colônias exiba áreas brancas dispersas. Em seguida, para começar a embalar as células, desenhe linhas de grade na superfície externa inferior das placas com um marcador para facilitar a cobertura precisa de toda a placa. Use um microscópio de contraste de fase de ampliação de 10x em um campo de cultura para separar colônias diferenciadas raspando manualmente com uma ponta de pipeta de 200 microlitros.Em seguida, lave as placas duas vezes com PBS. E, em seguida, adicione cinco mililitros de protease de dissociação tecidual pré-aquecida a 37 graus Celsius. Incube as células a 37 graus Celsius por quatro a sete minutos até que as bordas das colônias comecem a arredondar, antes de levantar as colônias da placa.Aspirar cuidadosamente a protease de dissociação e enxaguar suavemente a placa duas vezes com PBS sem desalojar as colónias. Adicione cinco mililitros de meio iPSC humano pré-aquecido à placa de cultura. Em seguida, risque toda a placa com uma ponta de uma pipeta de cinco mililitros usando um movimento de ida e volta de cima para baixo e levante as colônias enquanto as quebra em agregados celulares menores.Para diferenciação de iPSC humana em células progenitoras neurais. Uma vez que a iPSC humana forma uma monocamada e se torna 90% confluente, inicie a diferenciação conforme descrito no manuscrito. No 12º dia, após o tratamento com tripsina, se as células não estiverem em suspensão, separaram as células mecanicamente ejetando o meio de indução neural de uma ponta de pipeta de 1000 microlitros para as células com um movimento circular para cobrir toda a superfície.Se as culturas de células progenitoras neurais foram congeladas, descongele-as. Após troca de meio e enxágue PBS, conforme descrito no manuscrito, alterar o meio com um meio de diferenciação de neurônios motores contendo 0,02 citosina micromolar arabinosídeo e, em seguida, incubar as células por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono quando os progenitores gliais comprometidos emergirem como células planas de proliferação única sob progenitores de neurônios motores pós-mitóticos, agregados em aglomerados de células. Posteriormente, realizou troca de médiuns conforme indicado no manuscrito.No dia do chapeamento ou antes, comece a revestir as placas MEA de 24 poços diluindo primeiro a OLP em água ou PBS. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de PLO a cada poço formando uma gota no centro do poço, cobrindo a área do eletrodo garantindo não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta. Adicione água aos compartimentos ao redor dos poços, garantindo umidade suficiente.E incubar a OLP a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, usando uma ponta de micropipeta de plástico, aspirar o máximo de PLO possível sem tocar nos eletrodos. Em seguida, lave o poço com 250 microlitros de água três vezes.Usando uma ponta de pipeta, remova o máximo de água possível e deixe a superfície secar com a tampa removida. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de laminina diluída para cobrir cada matriz de eletrodos. Depois de adicionar água aos compartimentos de umidade e substituir a tampa, incube a 37 graus Celsius por um mínimo de duas horas até a noite.No dia do revestimento, depois de enxaguar os neurônios motores e as culturas de astrócitos uma vez com PBS, adicione 0,05% de tripsina e incube a 37 graus Celsius por cerca de cinco minutos para levantar as células. Colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo inibidor de tripsina. E lave as placas com meio ou base para garantir que todas as células sejam coletadas.Pellet para baixo as células por centrificação. E, em seguida, usando uma pipeta de 1000 microlitros, ressussuscite neurônios motores e astrócitos com um meio de co-cultura contendo 20 micromolares de inibidor de ROCK para gerar um mililitro de uma única suspensão celular. Usando um hemocitômetro, conte os neurônios motores e astrócitos.E durante a contagem, manteve as suspensões celulares e colocou-as em um rack de isopor a quatro graus Celsius. Centrifugar um mililitro de ambas as suspensões celulares a 300 vezes G durante cinco minutos. Calcule o volume desejado e ressuspenda os pellets.Combine o volume necessário de suspensões de neurônios e astrócitos em proporções iguais e misture suavemente pipetando duas vezes para combinar completamente. Em seguida, remova a laminina de cada poço da placa e transfira 10 microlitros da suspensão celular combinada final para cada poço, formando uma pequena gotícula cobrindo a matriz de eletrodos. Incubar as placas com uma gotícula de célula não perturbada a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos para formar anexos iniciais nas placas.Em seguida, pipetar 250 microlitros de meio de co-cultura quente contendo inibidor de ROCK na parede de cada poço e pipetar o mesmo volume na parede oposta de cada poço e incubar a placa a 37 graus Celsius por 24 a 36 horas. No dia seguinte, examine as placas em busca de detritos ou células mortas. E, se necessário, troque o meio por um meio de co-cultura fresco contendo inibidor de ROCK.Caso contrário, realize trocas médias duas vezes por semana usando um meio de co-cultura sem um inibidor de ROCK a partir do segundo dia de cocultura. Para realizar a gravação, comece o mais rápido possível após o primeiro dia de cocultura, ajustando a temperatura para 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5% Em seguida, transfira as placas para a máquina de gravação e equilibre-se por pelo menos cinco minutos antes da gravação. Registre a atividade de linha de base a cada dois dias ou semanalmente durante um a 15 minutos, dependendo do desenho experimental.Para investigar os efeitos eletrofisiológicos transitórios de compostos direcionados a neurônios ou astrócitos, remova a tampa da placa, mas mantenha a tampa da máquina fechada e registre a atividade basal por um mínimo de um minuto. Abra manualmente a tampa da máquina sem parar o registro eletrofisiológico e troque 25 microlitros de meio com o veículo de droga apropriado. Em seguida, feche a tampa manualmente e grave por mais minutos, se necessário.Da mesma forma, teste a droga de interesse. Neste protocolo, as hiPSCs foram mantidas e passadas como colônias não confluentes. A neurogênese foi iniciada através da inibição dupla da SMAD, inativando as vias BMP e TGF-beta.As células-tronco neuroepiteliais resultantes se dividiram e geraram um epitélio de várias camadas. A exposição precoce a fatores de crescimento neuronais e um fator neurotrófico ciliar gliogênico geraram uma população mista de células progenitoras. Os neurônios emergiram espontaneamente dessa população mista.O interruptor gliogênico induziu a diferenciação de astrócitos através da ativação da via JAK-STAT. A identidade da medula espinhal das células do neurônio motor tratadas e diferenciadas do inibidor da entalhe foi apoiada por altos níveis de expressão da acetiltransferase de colina. No 90º dia pós-cultura in vitro, os astrócitos humanos de iPSC apresentaram fenótipo de maturação, conforme indicado pela expressão de S100 beta e GFAP, enquanto sua identidade regional da medula espinhal foi apoiada pela expressão de falcões antes.Células co-cultivadas rearranjadas espontaneamente com astrócitos criando uma camada de alimentação na parte inferior e neurônios conectando redes na parte superior. Neurônios agregados em grandes aglomerados de células quando cultivados sozinhos, enquanto a co-cultura de neurônios motores iPSC humanos com astrócitos iPSC humanos resultou em monocamadas uniformemente distribuídas. Os astrócitos humanos da iPSC aumentaram a maturação eletrofisiológica dos neurônios motores da iPSC humana, como mostrado por graus mais altos de atividade de pico e explosão nas coculturas.Em nossa experiência, a cultura de células-tronco e a diferenciação precoce de NPCs são as mais difíceis e sensíveis a erros técnicos. Nesta fase, as técnicas não devem ser executadas com consistência e precisão, com pouca margem para solução de problemas. As técnicas de co-cultura descritas aqui também podem ser usadas em outros modelos específicos de tipo celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Neurociência

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartimentalização de neurônios derivados de células-tronco humanas dentro de chips de plástico Microfluídico pré-montados

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...