Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

وكانت أميرة د. أرغي، وبرينا أ. ي. ستيفنز، وسيلفيا ب. توماس، وجاكوب ج. إ. ييتس من الحاصلين على رواتب طلاب كلية أونتاريو البيطرية، فضلا عن منح الدراسات العليا في أونتاريو. كانت أميرة د. أرغي متلقية الحصول على كلية ميتاك لتسريع الطلاب. تم تمويل هذا العمل من قبل منحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (#66009) ومنحة مشاريع البحوث الصحية التعاونية (NSERC) (#433339) ل SKW.

1. مزدوجة plasmid transfection خلايا HEK293 في مداخن الخلية
<ol><li>إذابة قارورة التبريد من خلايا HEK293 في حمام حبة تعيين في 37 درجة مئوية. ملاحظة: DMEM كاملة قبل الحارة إلى 37 درجة مئوية في حين أن الخلايا تذوب لضمان درجة الحرارة الباردة لا صدمة الخلايا عند الطلاء. تأكد من أن الخلايا لديها عدد مرور منخفض ، أقل م?...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA.">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li><li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy:+challenges+and+potential+solutions.">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li><li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo.">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li><li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus.">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor.">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li><li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

يستخدم إنتاج ناقلات AAV المؤتلفة (rAAV) الموصوفة في هذه الورقة المواد والكواشف والمعدات الشائعة الموجودة في غالبية مختبرات ومرافق أبحاث البيولوجيا الجزيئية. تسمح هذه الورقة لإنتاج عالية الجودة في المختبر وفي الصف في الجسم الحي rAAV من قبل القارئ. وقبل كل شيء، فإن هذا البروتوكول لإنتا...

العلاج الجيني باستخدام ناقلات الفيروس المرتبطة أدينو (AAV) قد خطت خطوات كبيرة على مدى العقود الثلاثة الماضية1,2. أظهرت التحسينات في مجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية، بما في ذلك العمى الخلقي، والهيموفيليا، وأمراض الجهاز العصبي العضلي الهيكلي والمركزي، جلبت العلاج الجيني AAV إلى طليعة البحوث السريرية3،4. في عام 2012، وافقت وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) على غليبيرا، وهو ناقل AAV1 يعبر عن ليباز البروتين الدهني (LPL) لعلاج نقص LPL، مما يجعله أول تصريح تسويقي لعلاج العلاج الجيني في أوروبا أو الولايات المتحدة5. ومنذ ذلك الحين، حصل علاجان جينيان إضافيان من AAV، Luxturna6 و Zolgensma7،على موافقة إدارة الأغذية والعقاقير، ومن المتوقع أن يتوسع السوق بسرعة على مدى السنوات ال 5 المقبلة مع ما يصل إلى 10-20 العلاجات الجينية المتوقعة بحلول عام 20258. تشير البيانات السريرية المتاحة إلى أن العلاج الجيني AAV هو طريقة آمنة وجيدة التحمل وفعالة مما يجعله واحدا من أكثر ناقلات الفيروس الواعدة ، مع أكثر من 244 تجربة سريرية شملت AAV مسجلة مع ClinicalTrials.gov. الاهتمام المتزايد في التطبيقات السريرية التي تنطوي على ناقلات AAV يتطلب أساليب إنتاج قوية وقابلة للتطوير لتسهيل تقييم العلاجات AAV في النماذج الحيوانية الكبيرة، لأن هذا هو خطوة حاسمة في خط أنابيب9الترجمة .
لإنتاج ناقلات AAV ، فإن المتطلبات الرئيسية هما جينوم AAV و capsid. الجينوم من النوع البري (wt) - AAV هو الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل التي هي ما يقرب من 4.7 كيلو بايت في طول10. يضم جينوم wt-AAV تكرارات طرفية مقلوبة (ITRs) موجودة في طرفي الجينوم ، وهي مهمة للتغليف ، وجينات الممثل والغطاء 11. تتم إزالة الجينات مندوب وسقف، اللازمة لتكرار الجينوم، وتجميع capsid الفيروسية، وتغليف الجينوم في capsid الفيروسية، من الجينوم الفيروسية وتقدم في ترانس لإنتاج ناقلات AAV12. إن إزالة هذه الجينات من الجينوم الفيروسي يوفر مجالا للمتحولات العلاجية وجميع العناصر التنظيمية اللازمة، بما في ذلك المروج وإشارة تعدد الإرسال. تبقى ITRs في الجينوم ناقلات لضمان تكرار الجينوم السليم والتغليف الفيروسي13،14. لتحسين حركية التعبير المتحول ، يمكن هندسة جينوم ناقلات AAV ليكون متكاملا ذاتيا ، مما يخفف من الحاجة إلى التحويل من تحويل الحمض النووي أحادية التقطعت بهم السبل إلى تحويل الحمض النووي المزدوج أثناء تكرار جينوم AAV ، ولكنه يقلل من قدرة الترميز إلى ~ 2.4 kb15.
وراء تصميم الجينوم AAV، اختيار النمط المصلي capsid يحدد الأنسجة والخلايا تروبية من ناقلات AAV في الجسم الحي2. بالإضافة إلى التروبية الأنسجة، وقد ثبت مختلف الأنماط المصلية AAV لعرض مختلف الحركية التعبير الجيني16. على سبيل المثال، صنفت الزنكاريللي وآخرون17 أنماطا مصلية مختلفة للAV إلى أنماط مصلية منخفضة التعبير (AAV2 و3 و4 و5) وأنماط مصلية متوسطة التعبير (AAV1 و6 و8) وأنماط مصلية عالية التعبير (AAV7 و9). كما صنفوا الأنماط المصلية للAV إلى تعبير بطيء الظهور (AAV2 و3 و4 و5) أو تعبير سريع الظهور (AAV1 و6 و7 و8 و9). هذه التروبينات المتباينة وحركية التعبير الجيني ترجع إلى اختلافات الأحماض الأمينية في البروتينات الكابسيد، وتشكيلات البروتين capsid، والتفاعلات مع مستقبلات الخلايا المضيفة / المستقبلات المشتركة18. بعض capsids AAV لها خصائص مفيدة إضافية مثل القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ بعد الإدارة داخل الأوعية الدموية (AAV9) أو يقيمون في خلايا العضلات التي تعيش منذ فترة طويلة للتعبير عن المتحولين دائم (AAV6, 6.2FF, 8, و 9)19,20.
تهدف هذه الورقة إلى تفصيل طريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج ناقلات AAV عالية النقاء وعالية التأرت والبحث لاستخدامها في نماذج الحيوانات الكبيرة قبل السريرية. يتم إنتاج AAV باستخدام هذا البروتوكول باستخدام ثنائي البلازميد transfection في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293 الخلايا التي تزرع في مداخن الخلايا. وعلاوة على ذلك، تصف الدراسة بروتوكول لتنقية الكروماتوغرافيا تقارب كبريتات الهيبارين، والتي يمكن استخدامها للأنماط المصلية AAV التي تحتوي على نطاقات ربط الهيبارين، بما في ذلك AAV2، 3، 6، 6.2FF، 13، ودي جي21،22.
وهناك عدد من أنظمة التعبئة والتغليف المتاحة لإنتاج ناقلات AAV. من بين هذه ، فإن استخدام نظامين مشتركين في العدوى ، حيث يتم احتواء جينات Rep و Cap وجينات مساعد الإعلان (E1A و E1B55K و E2A و E4orf6 و VA RNA) داخل بلازميد واحد (pHelper) ، له بعض المزايا العملية على طريقة العدوى الشائعة ثلاثية البلازميد (الثلاثية) ، بما في ذلك انخفاض تكلفة إنتاج البلازميد23،24 . يجب أن يحيط ب PLASMID الجينوم AAV التي تحتوي على كاسيت التعبير transgene (pTransgene) ، من قبل ITRs ، ويجب ألا يتجاوز ~ 4.7 كيلوبايت في الطول. يمكن أن يتأثر تيتر الناقل والنقاء بالمتحول بسبب الآثار السامة للخلايا المحتملة أثناء العدوى. ويرد وصف لتقييم نقاء ناقلات الأمراض في هذه المسألة. تم تقييم ناقلات المنتجة باستخدام هذه الطريقة، والتي تسفر عن 1 ×10 13 vg/mL لكل منهما، في الفئران، الهامستر، والنماذج الحيوانية ovine.
الجدول 1: تكوين الحلول المطلوبة. المعلومات الضرورية، بما في ذلك النسب المئوية والأحجام، للمكونات اللازمة لمختلف الحلول في جميع أنحاء البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

تعد ناقلات الفيروسات المرتبطة بالأدينو من بين ناقلات العلاج الجيني الأكثر تقدما سريريا، مع اعتماد ثلاثة علاجات جينية AAV للبشر. التقدم السريري للتطبيقات الجديدة لAV ينطوي على الانتقال من نماذج الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران، إلى نماذج حيوانية أكبر، بما في ذلك ال كلاب، والأغنام، والرئيسيات غير البشرية. أحد القيود المفروضة على إعطاء AAV للحيوانات الكبيرة هو شرط كميات كبيرة من فيروس التيتر العالي. في حين أن ثقافة الخلايا المعلقة هي طريقة قابلة للتطوير لإنتاج ناقلات AAV ، إلا أن القليل من مختبرات الأبحاث لديها المعدات (مثل المفاعلات الحيوية) أو تعرف كيفية إنتاج AAV بهذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، فإن عوارض AAV غالبا ما تكون أقل بكثير عند إنتاجها في خلايا HEK 293 المعلقة مقارنة بخلايا HEK293 الملتصقة. وصف هنا هو وسيلة لإنتاج كميات كبيرة من AAV عالية titer باستخدام مداخن الخلية. كما يتم وصف بروتوكول مفصل لتكتيرينغ AAV وكذلك أساليب التحقق من صحة نقاء ناقلات. وأخيرا، يتم تقديم النتائج التمثيلية للتعبير المتحول بوساطة AAV في نموذج الأغنام. هذا البروتوكول الأمثل لإنتاج واسع النطاق من ناقلات AAV في الخلايا الملتصقة سيمكن مختبرات البيولوجيا الجزيئية من التقدم في اختبار علاجات AAV الجديدة في نماذج حيوانية أكبر.

الترجمة من نماذج القوارض الصغيرة إلى نماذج حيوانية أكبر والتطبيق السريري في نهاية المطاف يمثل تحديا كبيرا بسبب كمية كبيرة من AAV المطلوبة لتحويل الحيوانات الكبيرة وتحقيق الآثار العلاجية. لمقارنة كفاءة نقل AAV6.2FF capsid المصممة بشكل عقلاني ، أظهرت سابقا زيادة 101 مرة في كفاءة النقل في خلايا عضلة ...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

هنا نقدم إجراء مفصلا لإنتاج واسع النطاق من ناقلات AAV من الدرجة البحثية باستخدام خلايا HEK 293 الملتصقة المزروعة في أكوام الخلايا وتنقية الكروماتوغرافيا التقارب. ينتج هذا البروتوكول باستمرار >1 × 1013 جينوم/مل متجه، مما يوفر كميات متجهة مناسبة للدراسات الحيوانية الكبيرة.

إنتاج ناقلات الفيروسات المرتبطة أدينو في مداخن الخلايا للدراسات ما قبل السريرية في نماذج حيوانية كبيرة

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

هذا البروتوكول لإنتاج ناقلات AAV الفيروسية فعالة من حيث التكلفة وتسفر عن نقاء عالية، تيتر عالية، AAV درجة البحوث لاستخدامها في نماذج حيوانية كبيرة قبل السريرية. تستخدم هذه التقنية خلايا HEK293 الملتصقة في غرف زراعة الخلايا ، وهي فعالة من حيث الوقت وأقل عملية ، مما يسمح باضطرابات أقل في الخلايا. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول بشكل كبير في إنتاج ناقلات الفيروسات في مجال العلاج الجيني ، ويمكن استخدامه أيضا لإنتاج أنواع مصلية أخرى من AAV تربط أيضا كبريتات الهيباران.للبدء، جمع خلايا HEK293 من الثقافة عندما تصل إلى التقاء 80٪. يستنشق وسائل الإعلام قبل غسل بلطف لوحة ثقافة الخلية مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم يستنشق برنامج تلفزيوني وإضافة ثلاثة ملليلتر من التريبسين.احتضان لوحات لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، تحييد التربسين، بإضافة سبعة ملليلتر من DMEM كاملة إلى لوحة، وجمع supernatant في 50 أنابيب مخروطية ملليلتر. عكس الأنابيب بلطف لضمان الخلايا متجانسة.لتحديد كثافة الخلية، اخلط 10 ميكرولترات من عينات الخلية مع 10 ميكرولترات من أزرق التريبان. وإضافة الخليط إلى شريحة عد الخلايا لتحليل في عداد الخلية. مزيج تعليق الخلية مع لتر واحد من DMEM كاملة قبل تسخينها لرؤية غرفة الثقافة.تدوير الغرفة بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان الغرفة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالإضافة إلى غرفة ثقافة الخلية، خلايا الثقافة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في لوحة 15 سم كمرجع للالتقاء.بعد 65 ساعة من الحضانة ، عندما تكون الخلايا التقاء 80 إلى 90 ٪، إضافة ببطء خليط البولي إيثيلينيمين الحمض النووي وDMEM في ميناء غرفة ثقافة الخلية. توزيع السائل بالتساوي على جميع الصفوف قبل احتضان في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة، هز غرفة ثقافة الخلية بقوة لطرد الخلايا حتى تظهر الوسائط غائمة، وصبها في أربعة أو 500 أنبوب طرد مركزي ملليلتر.بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 18، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. صب supernatant أوضح في زجاجة PETG لتر واحد، وإعادة إنفاق الكريات الخلية في 50 ملليلتر من العازلة المرخصة في أنابيب الطرد المركزي 500 ملليلتر. احتضان الأنابيب لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.بعد الحضانة، طرد الأنابيب في 18، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة، ونقل supernatant في نفس زجاجة PETG لتر واحد. يخزن عند ناقص 80 درجة مئوية. إذابة lysate الخام في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بمجرد إذابته، قم بتصفية ذلك باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. قبل خطوات التنقية مباشرة، قم بتفعيل المكثف الطردي المركزي بإضافة أربعة ملليلترات من حاجز المعالجة المسبقة للمرشح لكل عمود من أعمدة الهيبارين-سيفاروز المستخدمة. ضع الأنابيب في مضخة معج.تشغيل الحلول والوسائط بشكل تسلسلي. الاستعداد للكروماتوغرافيا عن طريق إرفاق عمود الهيبارين سيباروز خمسة ملليلتر إلى الأنابيب، وتشغيل 25 ملليلتر من Bazell DMEM من خلال العمود. ثم تحميل 0.2 ميكرومولار من lysate الخام المصفاة على العمود بمعدل تدفق من 1 إلى 2 قطرات في الثانية الواحدة.اغسل العمود بالتسلسل إلى 5 ملليلترات خمس مرات مع 300 ملليمولار من كلوريد الصوديوم HBSS ، مع المغنيسيوم والكالسيوم ، وتسمية elutions الخمسة E1 إلى E5. عندما تكون جاهزة، تدور مركز الطرد المركزي التي تحتوي على العازلة قبل المعالجة في 900 مرة G لمدة دقيقتين. تجاهل التدفق من خلال. اغسل فلتر المكثف الطرد المركزي بأربعة ملليلترات من HBSS بالمغنيسيوم والكالسيوم عن طريق الدوران عند 1000 مرة G لمدة دقيقتين.ثم أضف elution E2 إلى المكثف الطرد المركزي، وتدور في 1000 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل التدفق من خلال. وبالمثل تدور elution E3 في مركز الطرد المركزي حتى الفيروس المركز هو ما يقرب من ملليلتر واحد.إزالة الفيروس المركز من مركز الطرد المركزي باستخدام طرف P200 المصفاة، وجمعه في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر معقمة. بعد جمع الفيروس، شطف المكثف الطرد المركزي مع 200 ميكرولتر من HBSS مع المغنيسيوم والكالسيوم. ماصة صعودا وهبوطا بقوة لمدة 30 ثانية لطرد أي فيروس تلتزم الغشاء، وجمع الفيروس المركزة في نفس أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.خلط أنبوب جيدا. غسل العمود وتشبع مع 20٪ الإيثانول قبل تخزينها في أربع درجات مئوية. تخزين أنابيب مضخة في هيدروكسيد الصوديوم الأضراس واحد.تمت مقارنة كفاءة نقل كابسيد AAV6.2FF في الفئران والهامستر والحملان لمدة 28 يوما عند الإدارة العضلية. الفئران تدار خمسة أضعاف 10 إلى الجينوم ناقلات 12th لكل كيلوغرام من AAV6.2FF IgG الإنسان، وأعرب عن ما بين 171 إلى 237 ميكروغرام لكل ملليلتر من IgG الإنسان في المصل. يتم إعطاء الهامستر في مرتين 10 إلى الجينوم ناقلات 13th لكل كيلوغرام من AAV6.2FF IgG الإنسان، وأعرب عن مستويات أعلى بكثير من IgG الإنسان من الفئران.في حين أن نموذج الحيوان الكبير كان قادرا على التعبير عن متوسط 35 ميكروغرام لكل ملليلتر من مستويات IgG البشرية في البلازما. يمكن للنماذج الحيوانية الكبيرة تحديد التعبير عن المتحول AAV في الجسم الحي ، وتحديد ما إذا كان للمتحولات تأثير علاجي ضد الاضطراب أو المرض المثير للاهتمام. وقد أظهرت الدراسة قدرة كبيرة على النقل من AAV6.2FF، رواية AAV 6 ناقلات النمط المصلي في العضلات الهيكل العظمي، فضلا عن انخفاض المناعة من ناقلات الفيروسية AAV في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

تقدير معدلات الإنتاج الفيروسات في النظم المائية

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

الهندسة وتطور فيروس الغدة اسوشيتد الاصطناعية (AAV) المتجهات العلاج الجيني عن طريق الحمض النووي العائلة الخلط

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

التصوير تلألؤ بيولوجي من نشاط إنزيم NADPH في مختلف النماذج الحيوانية

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

جمع وتجهيز العقد الليمفاوية من الحيوانات الكبيرة لتحليل الحمض النووي الريبي: التحضير للدراسات ترانسكريبتوميك العقدة الليمفاوية للأنواع الحيوانية الكبيرة

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...