Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas en Jacob G. E. Yates ontvingen Ontario Veterinary College Student Stipendommen en Ontario Graduate Scholarships. Amira D. Rghei ontving een Mitacs Accelerate Studentship. Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (# 66009) en een Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) grant (# 433339) aan SKW.

1. Dubbele plasmidetransfectie van HEK293-cellen in celstapels
<ol><li>Ontdooi een cryoflacon met HEK293-cellen in een kralenbad op 37 °C. OPMERKING: Verwarm volledige DMEM voor tot 37 °C terwijl de cellen ontdooien om ervoor te zorgen dat de koude temperatuur cellen niet schokt bij het plateren. Zorg ervoor dat de cellen een laag doorgangsgetal hebben, idealiter minder dan 20, om optimale groei en transfectie-efficiëntie te garanderen. Zorg ervoor dat de cellen gecertificeerd zijn om mycoplasma-vrij te zijn.</li...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA.">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li><li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy:+challenges+and+potential+solutions.">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li><li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo.">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li><li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus.">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor.">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li><li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

De productie van recombinante AAV (rAAV) vectoren beschreven in dit artikel maakt gebruik van gemeenschappelijke materialen, reagentia en apparatuur gevonden in de meerderheid van de moleculair biologische onderzoekslaboratoria en faciliteiten. Dit papier maakt het mogelijk om hoogwaardige in vitro en in vivo kwaliteit rAAV te produceren door de lezer. Bovenal is dit protocol voor rAAV-productie, vergeleken met meer vervelende protocollen met cesiumchloridezuivering, efficiënt en vermijdt het gebruik v...

Gentherapie met behulp van adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren heeft enorme vooruitgang geboekt in de afgelopen drie decennia1,2. Aangetoonde verbeteringen in een breed scala aan genetische ziekten, waaronder aangeboren blindheid, hemofilie en ziekten van het bewegingsapparaat en het centrale zenuwstelsel, hebben AAV-gentherapie naar de voorgrond van klinisch onderzoek gebracht3,4. In 2012 keurde het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) Glybera goed, een AAV1-vector die lipoproteïnelipase (LPL) tot expressie brengt voor de behandeling van LPL-deficiëntie, waardoor het de eerste handelsvergunning is voor een gentherapiebehandeling in Europa of de Verenigde Staten5. Sindsdien hebben twee extra AAV-gentherapieën, Luxturna6 en Zolgensma7,fda-goedkeuring gekregen en de markt zal naar verwachting de komende 5 jaar snel groeien met maar liefst 10-20 gentherapieën verwacht tegen 20258. Beschikbare klinische gegevens geven aan dat AAV-gentherapie een veilige, goed verdragen en effectieve modaliteit is, waardoor het een van de meest veelbelovende virale vectoren is, met meer dan 244 klinische onderzoeken met AAV geregistreerd bij ClinicalTrials.gov. De toenemende interesse in klinische toepassingen met AAV-vectoren vereist robuuste en schaalbare productiemethoden om de evaluatie van AAV-therapieën in grote diermodellen te vergemakkelijken, omdat dit een cruciale stap is in de translationele pijplijn9.
Voor de productie van AAV-vectoren zijn de twee belangrijkste vereisten het AAV-genoom en de capside. Het genoom van wild-type (wt)-AAV is enkelstrengs DNA dat ongeveer 4,7 kb lang is10. Het wt-AAV-genoom bestaat uit omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) aan beide uiteinden van het genoom, die belangrijk zijn voor verpakking, en de rep- en capgenen 11. De rep- en capgenen, die nodig zijn voor genoomreplicatie, assemblage van de virale capsid en inkapseling van het genoom in de virale capsid, worden uit het virale genoom verwijderd en in trans geleverd voor AAV-vectorproductie12. De verwijdering van deze genen uit het virale genoom biedt ruimte voor therapeutische transgenen en alle noodzakelijke regulerende elementen, waaronder de promotor en het polyA-signaal. De ITR's blijven in het vectorgenoom om te zorgen voor een goede genoomreplicatie en virale inkapseling13,14. Om de kinetiek van transgenexpressie te verbeteren, kunnen AAV-vectorgenomen worden ontworpen om zelfcomplementair te zijn, wat de behoefte aan conversie van enkelstrengs naar dubbelstrengs DNA-conversie tijdens AAV-genoomreplicatie vermindert, maar de codeercapaciteit vermindert tot ~ 2,4 kb15.
Naast het ontwerp van het AAV-genoom bepaalt capsid serotypeselectie het weefsel- en celtropisme van de AAV-vector in vivo2. Naast weefseltropisme is aangetoond dat verschillende AAV-serotypen verschillende genexpressiekinetiek vertonen16. Zincarelli et al.17 classificeerden bijvoorbeeld verschillende AAV-serotypen in serotypen met lage expressie (AAV2, 3, 4, 5), matige expressieserotypen (AAV1, 6, 8) en serotypen met hoge expressie (AAV7 en 9). Ze categoriseerden ook AAV-serotypen in langzaam optredende expressie (AAV2, 3, 4, 5) of snel optredende expressie (AAV1, 6, 7, 8 en 9). Deze divergente tropismen en genexpressiekinetiek zijn te wijten aan aminozuurvariaties in de capside-eiwitten, capside-eiwitformaties en interacties met gastheercelreceptoren / co-receptoren18. Sommige AAV-capsiden hebben extra gunstige eigenschappen, zoals het vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren na intravasculaire toediening (AAV9) of verblijven in langlevende spiercellen voor duurzame transgenexpressie (AAV6, 6.2FF, 8 en 9)19,20.
Dit artikel is bedoeld om een kosteneffectieve methode te beschrijven voor het produceren van zeer zuivere, hoogtiterige, onderzoekskwaliteit AAV-vectoren voor gebruik in preklinische grote diermodellen. Productie van AAV met behulp van dit protocol wordt bereikt met behulp van dual-plasmid transfectie in adheren human embryonic kidney (HEK)293 cellen gekweekt in celstapels. Verder beschrijft de studie een protocol voor heparinesulfaataffiniteitschromatografiezuivering, dat kan worden gebruikt voor AAV-serotypen die heparinebindende domeinen bevatten, waaronder AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 en DJ21,22.
Er zijn een aantal verpakkingssystemen beschikbaar voor de productie van AAV-vectoren. Onder deze, het gebruik van een twee-plasmide co-transfectie systemen, waarin de Rep en Cap genen en Ad helper genen (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6, en VA RNA) zijn opgenomen in één plasmide (pHelper), heeft een aantal praktische voordelen ten opzichte van de gemeenschappelijke drie-plasmide (triple) transfectie methode, waaronder lagere kosten voor plasmide productie23,24 . Het AAV-genoomplasmide dat de transgenexpressiecassette (pTransgene) bevat, moet worden geflankeerd door ITR's en mag niet langer zijn dan ~ 4,7 kb. Vectortiter en zuiverheid kunnen worden beïnvloed door het transgen als gevolg van mogelijke cytotoxische effecten tijdens transfectie. Beoordeling van vectorzuiverheid wordt hierin beschreven. Vectoren geproduceerd met behulp van deze methode, die een 1 x 1013 vg / ml voor elk opleveren, werden geëvalueerd in muizen, hamsters en schapen diermodellen.
Tabel 1: Samenstelling van de vereiste oplossingen. Noodzakelijke informatie, inclusief percentages en volumes, van componenten die nodig zijn voor verschillende oplossingen in het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

Adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren behoren tot de meest klinisch geavanceerde gentherapie vectoren, met drie AAV gentherapieën goedgekeurd voor mensen. Klinische vooruitgang van nieuwe toepassingen voor AAV omvat de overgang van kleine diermodellen, zoals muizen, naar grotere diermodellen, waaronder honden, schapen en niet-menselijke primaten. Een van de beperkingen van het toedienen van AAV aan grotere dieren is de vereiste voor grote hoeveelheden hoogtitervirus. Hoewel suspensiecelcultuur een schaalbare methode is voor de productie van AAV-vectoren, hebben maar weinig onderzoekslaboratoria de apparatuur (bijvoorbeeld bioreactoren) of weten ze hoe ze AAV op deze manier kunnen produceren. Bovendien zijn AAV-titers vaak aanzienlijk lager wanneer ze worden geproduceerd in suspensie HEK 293-cellen in vergelijking met adherente HEK293-cellen. Hier wordt een methode beschreven voor het produceren van grote hoeveelheden AAV met hoge titer met behulp van celstapels. Een gedetailleerd protocol voor het titeren van AAV en methoden voor het valideren van vectorzuiverheid worden ook beschreven. Ten slotte worden representatieve resultaten van AAV-gemedieerde transgene expressie in een schapenmodel gepresenteerd. Dit geoptimaliseerde protocol voor grootschalige productie van AAV-vectoren in adherente cellen zal moleculair biologische laboratoria in staat stellen om het testen van hun nieuwe AAV-therapieën in grotere diermodellen te bevorderen.

De vertaling van kleine knaagdiermodellen naar grotere diermodellen en uiteindelijke klinische toepassing vormt een aanzienlijke uitdaging vanwege de grote hoeveelheid AAV die nodig is om grotere dieren te transduceren en therapeutische effecten te bereiken. Om de transductie-efficiëntie van de rationeel ontworpen AAV6.2FF-capsid te vergelijken, toonde eerder een 101-voudige toename van transductie-efficiëntie in muizenspiercellen in vergelijking met AAV63, muizen, hamsters en lammeren kregen al...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor grootschalige productie van onderzoekskwaliteit AAV-vectoren met behulp van adherente HEK 293-cellen gekweekt in celstapels en affiniteitschromatografiezuivering. Dit protocol levert consequent >1 x 1013 vectorgenomen /ml op, wat vectorhoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor grote dierstudies.

Productie van Adeno-geassocieerde virusvectoren in celstapels voor preklinische studies in grote diermodellen

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Dit protocol voor de productie van AAV virale vectoren is kosteneffectief en levert een hoge zuiverheid, hoge titer, onderzoekskwaliteit AAV op voor gebruik in preklinische, grote diermodellen. Deze techniek maakt gebruik van adherente HEK293-cellen in celkweekkamers, wat tijdsefficiënt en minder hands-on is, waardoor er minder verstoringen van de cellen mogelijk zijn. Dit protocol kan enorm helpen bij de productie van virale vectoren op het gebied van gentherapie en kan ook worden gebruikt voor de productie van andere AAV-serotypen die ook heparansulfaat binden.Verzamel om te beginnen HEK293-cellen uit de cultuur wanneer deze 80% confluentie bereikt. Adem de media op voordat u de celkweekplaat voorzichtig wast met drie milliliter PBS. Aspirateer vervolgens PBS en voeg drie milliliter trypsine toe.Incubeer de platen gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer na incubatie trypsine door zeven milliliter volledige DMEM aan de plaat toe te voegen en verzamel het supernatant in conische buizen van 50 milliliter. Keer de buizen voorzichtig om om ervoor te zorgen dat de cellen homogeen zijn.Om de celdichtheid te bepalen, mengt u 10 microliter van de celmonsters met 10 microliter trypanblauw. En voeg het mengsel toe aan een celtellingsdia om te analyseren in de celteller. Meng de celsuspensie met een liter voorverwarmde complete DMEM om de kweekkamer te zien.Draai de kamer voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer de kamer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Naast de celkweekkamer, kweekcellen op 10 tot de vierde cellen per centimeter in het kwadraat in een plaat van 15 centimeter als referentie voor confluentie.Na 65 uur incubatie, wanneer de cellen 80 tot 90% confluent zijn, voegt u langzaam het polyethyleenimine-DNA- en DMEM-mengsel toe aan de celkweekkamerpoort. Verdeel de vloeistof gelijkmatig over alle rijen voordat u ze incubeert bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 72 uur. Schud na incubatie de celkweek krachtig om de cellen los te maken totdat het medium troebel lijkt en giet het in vier of 500 milliliter centrifugebuizen.Pellet de cellen door centrifugeren op 18.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Giet het geklaarde supernatant in een PETG-fles van één liter en resuspend de celkorrels in 50 milliliter gelicentieerde buffer in centrifugebuizen van 500 milliliter. Incubeer de buizen gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius.Centrifugeer na incubatie de buizen gedurende 30 minuten op 18.000 keer G en breng het supernatant over in dezelfde PETG-fles van één liter. Bewaren bij min 80 graden Celsius. Ontdooi het ruwe lysaat 's nachts bij vier graden Celsius.Eenmaal ontdooid, filtert u het met behulp van een filter van 0,22 micron. Passiveer onmiddellijk vóór de zuiveringsstappen de centrifugaalconcentrator door vier milliliter filtervoorbehandelingsbuffer toe te voegen voor elke heparine-sepharosekolom die wordt gebruikt. Plaats de slang in een peristaltische pomp.Voer de oplossingen en media sequentieel uit. Bereid je voor op chromatografie door een heparine-sepharosekolom van vijf milliliter aan de buis te bevestigen en 25 milliliter Bazell DMEM door de kolom te laten lopen. Laad vervolgens 0,2 micromolair van het gefilterde ruwe lysaat op de kolom met een stroomsnelheid van één tot twee druppels per seconde.Was de kolom achtereenvolgens om vijf milliliter vijf keer te elueren met 300 millimolair natriumchloride HBSS, met magnesium en calcium, en label de vijf elutieën als E1 tot E5. Als u klaar bent, draait u de centrifugaalconcentrator met de voorbehandelingsbuffer gedurende twee minuten op 900 maal G. Gooi de doorstroming weg. Was het centrifugaalconcentratorfilter met vier milliliter HBSS met magnesium en calcium door gedurende twee minuten op 1000 maal G te draaien.Voeg vervolgens de elutie E2 toe aan de centrifugaalconcentrator en draai gedurende vijf minuten op 1000 maal G. Gooi de doorstroming weg. Draai op dezelfde manier de elutie E3 in de centrifugaalconcentrator totdat het geconcentreerde virus ongeveer één milliliter is.Verwijder het geconcentreerde virus uit de centrifugaalconcentrator met behulp van een P200-gefilterde punt en verzamel het in een steriele centrifugebuis van 1,5 milliliter. Spoel na het verzamelen van het virus de centrifugaalconcentrator met 200 microliter HBSS met magnesium en calcium. Pipetteer krachtig op en neer gedurende 30 seconden om elk virus dat aan het membraan kleeft te verdrijven en verzamel het geconcentreerde virus in dezelfde 1,5 milliliter centrifugebuis.Meng de tube goed door elkaar. Was de kolom en verzadig met 20% ethanol voordat u deze bij vier graden Celsius bewaart. Bewaar de pompslang in één molair natriumhydroxide.De transductie-efficiëntie van de AAV6.2FF capsid werd vergeleken bij muizen, hamsters en lammeren gedurende 28 dagen na intramusculaire toediening. Muizen toegediend vijf keer 10 tot de 12e vector genomen per kilogram AAV6.2FF menselijk IgG, uitgedrukt tussen 171 en 237 microgram per milliliter menselijk IgG in het serum. Hamster wordt toegediend op twee keer 10 tot de 13e vector genomen per kilogram AAV6.2FF menselijk IgG, uitgedrukt veel hogere niveaus van menselijk IgG dan de muizen.Terwijl het grote diermodel in staat was om gemiddeld 35 microgram per milliliter menselijke IgG-niveaus in het plasma uit te drukken. Grote diermodellen kunnen de expressie van het AAV-transgen in vivo bepalen en bepalen of de transgenen een therapeutisch effect hebben tegen de aandoening of ziekte van belang. De studie heeft het grote transductievermogen van AAV6.2FF aangetoond, een nieuwe AAV 6 serotype vector in de skeletspieren, evenals de lage immunogeniciteit van AAV virale vectoren in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...