Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

अमीरा डी आरघी, ब्रेन्ना ए वाई स्टीवंस, सिल्विया पी थॉमस, और जैकब जी ई येट्स ओंटारियो वेटनरी कॉलेज के छात्र वजीफे के साथ-साथ ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप के प्राप्तकर्ता थे । अमीरा डी आरघेई एक Mitacs तेजी लाने के छात्रशिप के प्राप्तकर्ता थे । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (सीआईएचआर) परियोजना अनुदान (#66009) और एसकेडब्ल्यू को एक सहयोगी स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजनाएं (NSERC भागीदारी) अनुदान (#433339) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

1. सेल स्टैक में HEK293 कोशिकाओं का डबल प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन
<ol><li>37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक मनका स्नान में HEK293 कोशिकाओं की एक क्रायो-शीशी गल। नोट: पूर्व गर्म पूरा DMEM ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए, जबकि कोशिकाओ?...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA.">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li><li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy:+challenges+and+potential+solutions.">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li><li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo.">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li><li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus.">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor.">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li><li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

इस पेपर में वर्णित रिकॉम्बिनेंट एएवी (आरएवी) वैक्टर का उत्पादन आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान प्रयोगशालाओं और सुविधाओं के बहुमत में पाए जाने वाले सामान्य सामग्रियों, अभिकर्णों और उपकरणों का उपयोग करता ह...

एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर का उपयोग करने वाली जीन थेरेपी ने पिछले तीन दशकों में भारी प्रगति की है1,2। जन्मजात अंधापन, हीमोफीलिया, और मस्कुलोस्केलेटल और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रोगों सहित आनुवंशिक रोगों की एक विविध श्रृंखला में सुधार का प्रदर्शन किया, नैदानिक अनुसंधान3,4में सबसे आगे AAV जीन थेरेपी लाया है । 2012 में, यूरोपीय दवाएं एजेंसी (ईएमए) ने एलपीएल की कमी के उपचार के लिए लिपोप्रोटीन लिपेज (एलपीएल) व्यक्त करते हुए एक AAV1 वेक्टर ग्लाइबेरा को मंजूरी दी, जिससे यह यूरोप या संयुक्त राज्य अमेरिका5में जीन थेरेपी उपचार के लिए पहला विपणन प्राधिकरण बन गया। तब से, दो अतिरिक्त एएवी जीन चिकित्सा, लक्सटर्ना6 और Zolgensma7,एफडीए अनुमोदन प्राप्त हुआ है, और बाजार के रूप में कई के रूप में 10-20 जीन चिकित्सा २०२५8से उंमीद के साथ अगले 5 वर्षों में जल्दी से विस्तार की उंमीद है । उपलब्ध नैदानिक डेटा से संकेत मिलता है कि एएवी जीन थेरेपी एक सुरक्षित, अच्छी तरह से सहन की गई और प्रभावोत्पादक तौर-तरीके हैं जो इसे सबसे होनहार वायरल वैक्टर में से एक बनाते हैं, जिसमें ClinicalTrials.gov के साथ पंजीकृत एवीवी से जुड़े 244 नैदानिक परीक्षण शामिल हैं। एएवी वैक्टर से जुड़े नैदानिक अनुप्रयोगों में बढ़ती रुचि के लिए बड़े पशु मॉडलों में एएवी चिकित्सा के मूल्यांकन को सुविधाजनक बनाने के लिए मजबूत और स्केलेबल उत्पादन विधियों की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह ट्रांसलेशनल पाइपलाइन9में एक महत्वपूर्ण कदम है।
एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए, दो मुख्य आवश्यकताएं एएवी जीनोम और कैप्सिड हैं। जंगली प्रकार (wt) का जीनोम-एएवी एकल-फंसे डीएनए है जो लंबाई10में लगभग 4.7 किब है। डब्ल्यूटी-एएवी जीनोम में जीनोम के दोनों सिरों पर पाए जाने वाले उल्टे टर्मिनल रिपीट्स (आईटीआर) शामिल हैं, जो पैकेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं, और निरसित और कैप जीन11। प्रतिनिधि और टोपी जीन, जीनोम प्रतिकृति के लिए आवश्यक, वायरल कैप्सिड की असेंबली, और वायरल कैप्सिड में जीनोम के encapsulation, वायरल जीनोम से हटा दिया जाता है और एएवी वेक्टर उत्पादन12के लिए ट्रांस में प्रदान की जाती है । वायरल जीनोम से इन जीनों को हटाने से चिकित्सीय ट्रांसजीन और प्रमोटर और पॉलीए सिग्नल सहित सभी आवश्यक नियामक तत्वों के लिए जगह प्रदान की जाती है । आईटीआर वेक्टर जीनोम में बने हुए हैं ताकि जीनोम की उचित प्रतिकृति और वायरल एनकैप्सुलेशन13,14को सुनिश्चित किया जा सके । ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की गतिज में सुधार करने के लिए, एएवी वेक्टर जीनोम को आत्म-पूरक होने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जो एएवी जीनोम प्रतिकृति के दौरान एकल-फंसे डीएनए रूपांतरण से रूपांतरण की आवश्यकता को कम करता है, लेकिन कोडिंग क्षमता को ~ 2.4 केबी15तक कम कर देता है।
एएवी जीनोम डिजाइन से परे, कैप्सिड सेरोटाइप चयन वीवो2में एएवी वेक्टर के ऊतक और सेल ट्रॉपिज्म को निर्धारित करता है। ऊतक ट्रॉपिज्म के अलावा, विभिन्न एएवी सीरोटाइप को विभिन्न जीन अभिव्यक्ति काइनेटिक्स16प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, जिंकरेली एट अल17 ने विभिन्न एएवी सेरोटाइप्राइप को कम अभिव्यक्ति सेरोटाइप (एएवी 2, 3, 4, 5), मॉडरेट एक्सप्रेशन सेरोटाइप (एएवी 1, 6, 8) और उच्च अभिव्यक्ति सेरोटाइप्स (एएवी7 और 9) में वर्गीकृत किया। उन्होंने एएवी सेरोटाइप को धीमी शुरुआत वाली अभिव्यक्ति (एएवी 2, 3, 4, 5) या रैपिड-शुरुआत अभिव्यक्ति (AAV1, 6, 7, 8, और 9) में भी वर्गीकृत किया। ये भिन्न ट्रॉपिज्म और जीन अभिव्यक्ति गतिज कैप्सिड प्रोटीन, कैप्सिड प्रोटीन संरचनाओं में अमीनो एसिड विविधताओं और मेजबान सेल रिसेप्टर्स/सह-रिसेप्टर्स18के साथ बातचीत के कारण हैं । कुछ एएवी कैप्सिड में अतिरिक्त लाभकारी विशेषताएं होती हैं जैसे कि इंट्रावैस्कुलर एडमिनिस्ट्रेशन (एएवी9) के बाद रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने की क्षमता या टिकाऊ ट्रांसजीन अभिव्यक्ति (एएवी 6, 6.2 एफएफ, 8, और 9)19,20के लिए लंबे समय तक रहने वाली मांसपेशियों की कोशिकाओं में रहते हैं।
इस पेपर का उद्देश्य प्रीक्लिनिकल बड़े पशु मॉडलों में उपयोग के लिए उच्च शुद्धता, उच्च-टाइटर, अनुसंधान ग्रेड एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए लागत प्रभावी विधि का विस्तार करना है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एएवी का उत्पादन कोशिका के ढेर में उगाए जाने वाले अनुयायी मानव भ्रूणीय गुर्दे (एचईके) 293 कोशिकाओं में दोहरी-प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, अध्ययन हेपरिन सल्फेट आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिसका उपयोग एएवी सेरोटाइप के लिए किया जा सकता है जिसमें हेपरिन-बाध्यकारी डोमेन होते हैं, जिनमें एएवी2, 3, 6, 6.2 एफएफ, 13 और डीजे21,22शामिल हैं।
एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए कई पैकेजिंग सिस्टम उपलब्ध हैं। इनमें से, दो-प्लाज्मिड सह-ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग, जिसमें प्रतिनिधि और कैप जीन और विज्ञापन सहायक जीन (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6, और VA RNA) एक प्लाज्मिड (pHelper) के भीतर निहित हैं, आम तीन प्लाज्मिड (ट्रिपल) ट्रांसफेक्शन विधि पर कुछ व्यावहारिक लाभ है, प्लाज्मिड उत्पादन के लिए कम लागत सहित23,24 . ट्रांसजीन एक्सप्रेशन कैसेट (pTransgene) युक्त एएवी जीनोम प्लाज्मिड, आईटीआर द्वारा घिरा होना चाहिए, और लंबाई में ~ 4.7 किलो से अधिक नहीं होना चाहिए। ट्रांसफैक्शन के दौरान संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों के कारण ट्रांसजीन द्वारा वेक्टर टाइटर और शुद्धता प्रभावित हो सकती है। वेक्टर शुद्धता का आकलन यहां वर्णित है। इस विधि का उपयोग करके उत्पादित वैक्टर, जो प्रत्येक के लिए 1 x 1013 वीजी/एमएल उपज, चूहों, हम्सटर और ओवाइन पशु मॉडल में मूल्यांकन किया गया था।
तालिका 1: आवश्यक समाधानों की संरचना। प्रोटोकॉल के दौरान विभिन्न समाधानों के लिए आवश्यक घटकों के प्रतिशत और मात्रा सहित आवश्यक जानकारी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

Adeno से जुड़े वायरस (AAV) वैक्टर सबसे चिकित्सकीय उन्नत जीन थेरेपी वैक्टर के बीच में हैं, तीन AAV जीन मनुष्यों के लिए मंजूरी दे दी चिकित्सा के साथ । एएवी के लिए उपन्यास अनुप्रयोगों की नैदानिक उन्नति में छोटे पशु मॉडलों से संक्रमण शामिल है, जैसे चूहों, कुत्तों, भेड़ और अमानवीय वानरों सहित बड़े पशु मॉडल में। बड़े जानवरों के लिए एएवी प्रशासन की सीमाओं में से एक उच्च टाइटर वायरस की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता है । जबकि निलंबन सेल संस्कृति एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए एक स्केलेबल विधि है, कुछ शोध प्रयोगशालाओं में उपकरण (जैसे, बायोरिएक्टर) हैं या जानते हैं कि इस तरीके से एएवी का उत्पादन कैसे किया जाए। इसके अलावा, एएवी टाइटर्स अक्सर काफी कम होते हैं जब अनुयायी HEK293 कोशिकाओं की तुलना में निलंबन HEK 293 कोशिकाओं में उत्पादित होता है। यहां वर्णित सेल स्टैक का उपयोग करके बड़ी मात्रा में उच्च-टाइटर एएवी का उत्पादन करने के लिए एक विधि है। एएवी के साथ-साथ वेक्टर शुद्धता को मान्य करने के तरीकों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी वर्णित किया गया है। अंत में, एक भेड़ मॉडल में एएवी-मध्यस्थता ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं। अनुयायी कोशिकाओं में एएवी वैक्टर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं को बड़े पशु मॉडलों में अपने उपन्यास एएवी चिकित्सा के परीक्षण को आगे बढ़ाने में सक्षम बनाएगा।

छोटे कृंतक मॉडल से बड़े पशु मॉडल और अंततः नैदानिक आवेदन के लिए अनुवाद बड़े जानवरों को स्थानांतरित करने और चिकित्सीय प्रभाव प्राप्त करने के लिए आवश्यक एएवी की बड़ी राशि के कारण एक महत्वपूर्ण चुनौती प्?...

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Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

यहां हम कोशिका ढेर और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण में उगाई जाने वाली अनुयायी एचईके 293 कोशिकाओं का उपयोग करके अनुसंधान-ग्रेड एएवी वैक्टर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल लगातार >1 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल की पैदावार करता है, जो बड़े पशु अध्ययनों के लिए उपयुक्त वेक्टर मात्रा प्रदान करता है ।

बड़े पशु मॉडल में प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए सेल स्टैक में एडेनो-एसोसिएटेड वायरस वैक्टर का उत्पादन

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

एएवी वायरल वैक्टर के उत्पादन के लिए यह प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है और प्रीक्लिनिकल, बड़े पशु मॉडलों में उपयोग के लिए उच्च शुद्धता, उच्च टाइटर, अनुसंधान ग्रेड एएवी पैदा करता है। यह तकनीक कोशिका संस्कृति कक्षों में अनुयायी HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करती है, जो समय कुशल और कम हाथों पर है, जिससे कोशिकाओं में कम व्यवधान ों की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल जीन थेरेपी के क्षेत्र के लिए वायरल वेक्टर उत्पादन में बहुत सहायता कर सकता है, और इसका उपयोग अन्य एएवी सेरोटाइप के उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है जो हेपरन सल्फेट को भी बांधते हैं।शुरू करने के लिए, संस्कृति से HEK293 कोशिकाओं को इकट्ठा जब यह ८०% संकुचन तक पहुंचता है । पीबीएस के तीन मिलीलीटर के साथ सेल कल्चर प्लेट को धीरे से धोने से पहले मीडिया को आकांक्षी करें। फिर पीबीएस को एस्पिरेट करें और तीन मिलीलीटर ट्राइपसिन जोड़ें।प्लेटों को दो मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्लेट में पूर्ण डीएमईएम के सात मिलीलीटर जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें, और 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में सुपरनैटर एकत्र करें। धीरे-धीरे ट्यूबों को उलटा यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं समरूप हैं।सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए, ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोलीटर के साथ सेल नमूनों के 10 माइक्रोलीटर मिलाएं। और सेल काउंटर में विश्लेषण करने के लिए एक सेल गिनती स्लाइड करने के लिए मिश्रण जोड़ें। संस्कृति कक्ष को देखने के लिए सेल निलंबन को एक लीटर पूर्व गरम पूर्ण डीएमईएम के साथ मिलाएं।कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए धीरे-धीरे कक्ष घुमाएं। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर चैंबर इनक्यूबेट। सेल संस्कृति कक्ष के अलावा, संस्कृति कोशिकाओं को 10 से चौथी कोशिकाओं प्रति सेंटीमीटर की दूरी पर एक 15 सेंटीमीटर की थाली में चुकता के रूप में एक संदर्भ के रूप में ।इनक्यूबेशन के 65 घंटे के बाद, जब कोशिकाएं 80 से 90% कॉन्फ्लूंट होती हैं, तो धीरे-धीरे सेल कल्चर चैंबर पोर्ट में पॉलीथीनिमाइन-डीएनए और डीएमईएम मिश्रण जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग से पहले सभी पंक्तियों के लिए समान रूप से तरल वितरित करें, और 72 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड। इनक्यूबेशन के बाद, सेल संस्कृति कक्ष को तेजी से हिला कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना जब तक मीडिया बादल दिखाई देता है, और यह चार या ५०० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डालना ।चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 18, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार । एक लीटर पीईटीजी बोतल में स्पष्ट सुपरनैटेंट डालो, और 500 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में लाइसेंस प्राप्त बफर के 50 मिलीलीटर में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट तक इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, 30 मिनट के लिए 18, 000 बार जी पर ट्यूबों को अपक्त करें, और सुपरनैंट को उसी एक लीटर पीईटीजी बोतल में स्थानांतरित करें। माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। रात में चार डिग्री सेल्सियस पर क्रूड की गिरावट दर्ज की गई ।एक बार गल जाने के बाद, इसे 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। शुद्धिकरण चरणों से तुरंत पहले, उपयोग किए जा रहे प्रत्येक हेपरिन-सेफेरोज कॉलम के लिए फिल्टर प्रीट्रीटर के चार मिलीलीटर जोड़कर अपकेंद्रित्र ध्यानात्मक को पासिवेट करें। ट्यूबिंग को पेरिस्टाल्टिक पंप में रखें।क्रमिक रूप से समाधान और मीडिया चलाते हैं। टयूबिंग के लिए पांच मिलीलीटर हेपरिन-सेफरोज कॉलम संलग्न करके क्रोमेटोग्राफी के लिए तैयार करें, और कॉलम के माध्यम से बाजेल डीएमईएम के 25 मिलीलीटर चला रहे हैं। इसके बाद एक से दो बूंद प्रति सेकंड की फ्लो रेट पर फिल्टर्ड क्रूड का 0.2 माइक्रोमॉलर कॉलम पर लोड करें।पांच मिलीलीटर को पांच बार सोडियम क्लोराइड एचबीएसएस के ३०० मिलीमोलर के साथ मैग्नीशियम और कैल्शियम के साथ अलग-क्रमबद्ध रूप से धोएं, और पांच एल्यूशन को E1 से E5 के रूप में लेबल करें । तैयार होने पर, दो मिनट के लिए 900 बार जी पर प्रीट्रीटमेंट बफर युक्त अपकेंद्रित्र ध्यानात्मक स्पिन करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। दो मिनट के लिए 1000 बार जी पर घूमते हुए मैग्नीशियम और कैल्शियम के साथ एचबीएसएस के चार मिलीलीटर के साथ अपकेंद्रित्र ध्यानात्मक फिल्टर धोएं।फिर अपकेंद्रित्र ध्यान देने वाले को एल्यूशन E2 जोड़ें, और पांच मिनट के लिए 1000 बार जी पर स्पिन करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। इसी तरह संगम E3 को अपकेंद्रित्र ध्यान में तब तक स्पिन करें जब तक कि केंद्रित वायरस लगभग एक मिलीलीटर न हो जाए।एक P200 फ़िल्टर टिप का उपयोग कर अपकेंद्रित्र ध्यान से केंद्रित वायरस निकालें, और यह एक बाँझ १.५ मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा । वायरस के संग्रह के बाद, मैग्नीशियम और कैल्शियम के साथ एचबीएसएस के 200 माइक्रोलीटर के साथ अपकेंद्रित्र ध्यानक कुल्ला। किसी भी वायरस को झिल्ली का पालन करने के लिए 30 सेकंड के लिए तेजी से ऊपर और नीचे पिपेट करें, और उसी 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में केंद्रित वायरस एकत्र करें।नलकूप मिला लें। कॉलम को धोएं और चार डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले 20% इथेनॉल के साथ संतृप्त करें। पंप ट्यूबिंग को एक मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड में स्टोर करें।AAV6.2FF कैप्सिड की ट्रांसडक्शन दक्षता की तुलना चूहों, हम्सटर और मेमनों में इंट्रामस्क्युलर प्रशासन पर 28 दिनों के लिए की गई थी। चूहों ने सीरम में मानव आईजीजी के १७१ से २३७ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के बीच व्यक्त किए गए AAV6.2FF मानव आईजीजी के प्रति किलोग्राम 12वें वेक्टर जीनोम को पांच गुना 10 प्रशासित किया । हम्सटर को दो बार 10 में AAV6.2FF मानव आईजीजी के प्रति किलोग्राम 13 वें वेक्टर जीनोम के लिए प्रशासित किया जाता है, चूहों की तुलना में मानव आईजीजी के बहुत उच्च स्तर को व्यक्त किया जाता है।जबकि बड़े पशु मॉडल प्लाज्मा में मानव आईजीजी स्तर के प्रति मिलीलीटर औसतन ३५ माइक्रोग्राम व्यक्त करने में सक्षम था । बड़े पशु मॉडल वीवो में एएवी ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति निर्धारित कर सकते हैं, और यह निर्धारित कर सकते हैं कि ट्रांसजीन विकार या ब्याज की बीमारी के खिलाफ चिकित्सीय प्रभाव है या नहीं। अध्ययन में AAV6.2FF की महान ट्रांसडक्शन क्षमता, कंकाल की मांसपेशी में एक उपन्यास एएवी 6 सेरोटाइप वेक्टर, साथ ही वीवो में एएवी वायरल वैक्टर की कम इम्यूनोजेनिसिटी का प्रदर्शन किया गया है ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

एक्वाटिक सिस्टम में वायरस उत्पादन दरें आकलन

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

एलेक्सा Fluor लेबल के माध्यम से डेंगू वायरस Visualizing

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

उत्पादन और पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

डीएनए परिवार फेरबदल के माध्यम से इंजीनियरिंग और सिंथेटिक वायरस एडिनो - एसोसिएटेड का विकास (AAV) जीन थेरेपी वैक्टर

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase गतिविधि के विभिन्न पशु मॉडल में bioluminescence इमेजिंग

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

न्युट्रोफिल अलगाव और विश्लेषण करने के लिए चिकित्सीय एजेंट लिंफोमा सेल संवेदनशीलता में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

एक सरल और कुशल दृष्टिकोण उत्परिवर्ती चेचक वायरस वैक्टर का निर्माण करने के लिए

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

इंफ्लूएंजा संक्रमण के एक माउस मॉडल में एक वायरस अध्ययन

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

आरएनए विश्लेषण के लिए बड़े जानवरों से लिम्फ नोड्स के संग्रह और प्रसंस्करण: बड़े पशु प्रजातियों के लिम्फ नोड Transcriptomic अध्ययन के लिए तैयारी

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...