Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
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アミラ・D・Rghei,ブレナ・A・Y・スティーブンス,シルビア・P・トーマス,ジェイコブ・G・E・イェーツは,オンタリオ獣医大学学生奨学金とオンタリオ州大学院奨学金の受給者でした。アミラ・D・ルガイは、学生シップを加速するミタクの受領者でした。この研究は、カナダ保健研究所(CIHR)プロジェクトグラント(#66009)とSKWへの共同健康研究プロジェクト(NSERC提携)助成金(#433339)によって資金提供されました。

1. 細胞スタック中のHEK293細胞の二重プラスミドトランスフェクション
<ol><li>37°Cに設定されたビーズ浴中のHEK293細胞のクライオバイアルを解凍します。 注:セルが解凍されている間、完全なDMEMを37°Cに完全に完全に保ち、冷温がメッキ時にセルに衝撃を与えないようにします。細胞の通過数が20未満の場合、最適な増殖とトランスフェクション効率を確保します。細胞がマイコプラズマフ?...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. 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H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus.">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

本論文で説明する組換えAAV(rAAV)ベクターの製造は、分子生物学の研究室や施設の大部分に見られる一般的な材料、試薬、および装置を使用しています。本論文は、高品質 のインビトロ および インビボ グレードrAAVを読者が生産することを可能にする。とりわけ、rAAV製造のためのこのプロトコルは、塩化セシウム精製を含むより退屈なプロトコルと比較して、効率的であり、超?...

アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを利用した遺伝子治療は、過去30年間で大きく進歩した1,2.先天性失明、血友病、および筋骨格系および中枢神経系の疾患を含む多様な遺伝性疾患の改善を実証し、AAV遺伝子治療を臨床研究の最前線に持ち込んだ3,4。2012年、欧州医薬品庁(EMA)は、LPL欠損症の治療のためにリポタンパク質リパーゼ(LPL)を発現するAAV1ベクターであるグリベラを承認し、欧州または米国のいずれかで遺伝子治療のための最初のマーケティング承認を受けました。それ以来、2つのAAV遺伝子治療、Luxturna6とZolgensma7は、FDAの承認を受けており、市場は2025年までに10〜20の遺伝子治療が予想され、今後5年間で急速に拡大すると予想されています 8.利用可能な臨床データは、AAV遺伝子治療が安全で、十分に許容され、有効性のあるモダリティであり、最も有望なウイルスベクターの1つであり、244以上の臨床試験が ClinicalTrials.gov に登録されていることを示しています。AAVベクターを含む臨床応用への関心の高まりは、大規模な動物モデルにおけるAAV療法の評価を容易にするために、堅牢でスケーラブルな生産方法を必要とします。
AAVベクターの生産の場合、2つの主な要件は、AAVゲノムとキャプシドです。野生型(wt)-AAVのゲノムは、長さ約4.7kbの一本鎖DNAである。wt-AAVゲノムは、ゲノムの両端に見られる反転末端反復(ITR)を含み、これは、包装にとって重要であり、repおよびcap遺伝子11とを含む。Repおよびcap遺伝子は、ゲノム複製に必要な、ウイルスキャプシドの組み立て、およびゲノムをウイルスキャプシドにカプセル化し、ウイルスゲノムから除去され、AAVベクター産生12のためのトランスで提供される。ウイルスゲノムからこれらの遺伝子を除去することにより、治療的トランス遺伝子およびプロモーターおよびポリAシグナルを含むすべての必要な調節要素の余地を提供する。ITRは、適切なゲノム複製およびウイルスカプセル化13、14を確実にするために、ベクターゲノムに残る。遺伝子導入発現の動態を改善するために、AAVベクターゲノムは自己相補的に設計することができ、AAVゲノム複製中の一本鎖から二本鎖DNA変換への変換の必要性を軽減するが、コーディング能力は〜2.4kb15に低下する。
AAVゲノム設計を超えて、カプシド血清型選択は、生体内2におけるAAVベクターの組織および細胞のトロピズムを決定する。組織トロピズムに加えて、異なるAAV血清型が異なる遺伝子発現動態16を示すことを示している。例えば、ジンガレッリら17は、異なるAAV血清型を低発現血清型(AAV2、3、4、5)に分類し、中程度の発現血清型(AAV1、6、8)、および高発現血清型(AAV7および9)を分類する。また、AAV血清型を遅発式(AAV2、3、4、5)または急速発症発現(AAV1、6、7、8、および9)に分類した。これらの異なる対流動性および遺伝子発現動態は、カプシドタンパク質におけるアミノ酸の変化、カプシドタンパク質形成、および宿主細胞受容体/共受容体18との相互作用によるものである。一部のAAVカプシドは、血管内投与後に血液脳関門を越える能力(AAV9)または持続性トランスジーン発現用の長生き筋細胞(AAV6、6.2FF、8、および9)19、20などの付加的な有益な特徴を有する。
本論文は、前臨床前の大型動物モデルで使用するための高純度、高力価、研究グレードのAAVベクターを製造するための費用対効果の高い方法を詳述することを目的とする。このプロトコルを用いたAAVの生産は、細胞スタックで増殖した接着ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞へのデュアルプラスミドトランスフェクションを使用して達成される。さらに、この研究は、ヘパリン硫酸親和性クロマトグラフィー精製のプロトコルを記述し、AAV2、3、6、6.2FF、13、およびDJ21、22を含むヘパリン結合ドメインを含むAAV血清型に使用することができる。
AAV ベクターの製造には、多数のパッケージング システムが用意されています。これらの中で、RepおよびCap遺伝子およびアドヘルパー遺伝子(E1A、E1B55K、E2A、E4orf6、およびVA RNA)が1つのプラスミド(pHelper)内に含まれる2プラスミド共トランスフェクションシステムの使用は、一般的な3種プラスミド(トリプル)トランスフェクション方法よりも実用的な利点を有する24000年2400年の産生に対するコストの削減を含む。.遺伝子導入発現カセット(pTransgene)を含むAAVゲノムプラスミドは、ITRによって横にされ、かつ、〜4.7kbの長さを超えてはなりません。ベクター力差および純度は、トランスフェクション中の細胞傷害作用の可能性に起因するトランスジーンの影響を受ける可能性がある。ベクター純度の評価は、本明細書に記載される。この方法を用いて産生されたベクターは、それぞれ1x10 13 vg/mLを生み出し、マウス、ハムスター、およびオビン動物モデルで評価した。
表1: 必要なソリューションの構成プロトコル全体でさまざまなソリューションに必要なコンポーネントの割合やボリュームなどの必要な情報。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、ヒトに対して承認された3つのAAV遺伝子治療を有する、最も臨床的に進行した遺伝子治療ベクターの一つです。AAVの新しいアプリケーションの臨床進歩は、マウスなどの小さな動物モデルから、犬、羊、非ヒト霊長類を含むより大きな動物モデルへの移行を伴う。AAVを大型動物に投与する際の制限の1つは、大量の高い抗長ウイルスの要件である。懸濁細胞培養はAAVベクター産生のためのスケーラブルな方法であるが、いくつかの研究ラボは、装置(例えば、バイオリアクター)を有するか、またはこの方法でAAVを生成する方法を知っている。また、AAV価は、接着性HEK293細胞と比較して、HEK293細胞の懸濁液で産生される場合に有意に低いことが多い。ここで説明する、セルスタックを用いて大量の高力素AAVを製造する方法を説明する。AAV を引き起す詳細なプロトコルと、ベクター純度を検証する方法についても説明します。最後に、羊モデルにおけるAAV媒介トランスジーン発現の代表結果を提示する。この最適化されたAAVベクターを接着細胞で大規模に生産するためのプロトコルは、分子生物学の研究室が、より大きな動物モデルにおける新しいAAV療法の試験を進めることを可能にする。

小さなげっ歯類モデルから大型動物モデルへの翻訳と最終的な臨床応用は、大きな動物をトランスデュースし、治療効果を達成するために必要な大量のAAVに大きな課題を提示します。合理的に設計されたAAV6.2FFキャプシドの導入効率を比較するために、以前はAAV63と比較してマウス筋細胞における導入効率の101倍の増加を実証し、マウス、ハムスター、および子羊はすべてヒ...

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Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

ここでは、細胞スタックで増殖した付着HEK 293細胞とアフィニティークロマトグラフィー精製を用いた研究用AAVベクターの大規模生産に関する詳細な手順を提供する。このプロトコルは一貫して>1 x 1013 のベクターゲノム/mLを生成し、大規模な動物実験に適したベクター量を提供する。

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

AAVウイルスベクターの生産のためのこのプロトコルは、費用対効果が高く、前臨床、大規模な動物モデルでの使用のための高純度、高価価物、研究グレードAAVをもたらす。この技術は、細胞培養チャンバーに付着性HEK293細胞を使用し、時間効率が良く、実践的に少なく、細胞への破壊を減らすことを可能にする。このプロトコルは、遺伝子治療の分野のためのウイルスベクター産生に大いに役立ち、またヘパラン硫酸に結合する他のAAV血清型の産生に使用することができる。開始するには、80%合流に達したときに培養液からHEK293細胞を採取する。PBSを3ミリリットルで細胞培養板を静かに洗浄する前に培地を吸引する。その後、PBSを吸引し、トリプシンの3ミリリットルを追加します。プレートを摂氏37度で2分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンを中和し、プレートに完全DMEMの7ミリリットルを加え、50ミリリットル円錐形チューブに上清を集める。細胞が均質であることを確認するために、チューブを穏やかに反転させます。細胞密度を決定するには、細胞サンプルの10マイクロリットルを10マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。そして、セルカウンターで分析するためにセルカウントスライドに混合物を追加します。培養チャンバーを見るために、予め温めた完全なDMEMの1リットルと細胞懸濁液を混合する。チャンバーをそっと回転させて細胞を均等に分配します。5%の二酸化炭素で37°Cでチャンバーをインキュベートします。細胞培養チャンバーに加えて、培養細胞は10〜4センチメートルの培養細胞を合流性の基準として15センチメートルのプレートに2乗した。65時間のインキュベーション後、細胞が80〜90%コンフルエントである場合、ポリエチレンイミン-DNAとDMEM混合物を細胞培養チャンバーポートにゆっくりと加える。液体を摂氏37度でインキュベートする前にすべての列に均等に分配し、72時間の二酸化炭素を5%ずつ分配します。インキュベーション後、細胞培養チャンバーを激しく振って、媒体が濁って見えるまで細胞を外し、4または500ミリリットルの遠心分離管に注ぎます。細胞を摂氏4度で30分間18,000倍Gで遠心分離してペレットする。明確化した上清を1リットルのPETGボトルに注ぎ、500ミリリットル遠心分離管で50ミリリットルの認可されたバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。37°Cで60分間チューブをインキュベートします。インキュベーション後、チューブを18,000倍Gで30分間遠心し、上清を同じ1リットルPETGボトルに移します。マイナス80度で保管してください。粗いライセートを一晩摂氏4度で解凍します。解凍したら、0.22ミクロンフィルタを使用してフィルタリングします。精製ステップの直前に、使用されている各ヘパリン-セファローズカラムに4ミリリットルのフィルター前処理バッファーを加えて遠心濃縮器をパッシベーションします。チューブを蠕動ポンプに入れる。ソリューションとメディアを順次実行します。5ミリリットルのヘパリン-セファローズカラムをチューブに取り付け、カラムを通して25ミリリットルのBazell DMEMを実行してクロマトグラフィーの準備をします。その後、濾過された粗いライセートの0.2マイクロモルを1秒あたり1〜2滴の流量でカラムに積み込みます。カラムを順次洗浄して、塩化ナトリウムHBSSの300ミリモル、マグネシウム、カルシウムで5ミリリットルを5回溶出し、5つの溶出物をE1〜E5とラベル付けします。準備ができたら、前処理バッファーを含む遠心濃縮器を 900 回 G で 2 分間回転させます。フロースルーを破棄します。遠心濃縮器フィルターを4ミリリットルのHBSSでマグネシウムとカルシウムで洗浄し、Gを1000倍2分間回転させます。次に、遠心濃縮器に溶出E2を加え、Gの1000倍で5分間回転します。フロースルーを破棄します。同様に、溶出E3を遠心濃縮器に回し、濃縮ウイルスが約1ミリリットルになるまで回転させる。P200フィルターチップを使用して遠心濃縮器から濃縮ウイルスを除去し、滅菌1.5ミリリットル遠心分離管に集める。ウイルスの採取後、遠心濃縮器を200マイクロリットルのHBSSでマグネシウムとカルシウムで洗浄します。ピペットは、膜に付着したウイルスを取り除くために30秒間激しく上下し、同じ1.5ミリリットル遠心管に濃縮ウイルスを集める。チューブをよく混ぜます。カラムを洗い、摂氏4度で保存する前に20%エタノールで飽和させます。ポンプチューブを1モル水酸化ナトリウムに保管します。AAV6.2FFカプシドの導入効率を、筋肉内投与時に28日間マウス、ハムスター、およびラムで比較した。マウスは、AAV6.2FFヒトIgGの1キログラム当たり12番目のベクターゲノムに10回10回投与し、血清中のヒトIgGのミリリットル当たり171〜237マイクログラムの間で発現した。ハムスターは、AAV6.2FFヒトIgGの1キログラム当たり13番目のベクターゲノムの2倍10〜13番目のベクターゲノムで投与され、マウスよりもヒトIgGのレベルがはるかに高く発現した。一方、大型動物モデルは、血漿中のヒトIgGレベルの1ミリリットル当たり平均35マイクログラムを発現することができた。大型動物モデルは、In vivoにおけるAAVトランスジーンの発現を決定し、そして、トランス遺伝子が目的の障害または疾患に対して治療効果を有するかどうかを決定することができる。この研究は、骨格筋における新しいAAV 6血清型ベクターであるAAV6.2FFの偉大な形質導入能力と、生体内でのAAVウイルスベクターの低免疫原性を示した。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

水系でのウイルス産生率を予測

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

免疫・感染学

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

異なる動物モデルにおけるNADPHオキシダーゼ活性の生物発光イメージング

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...