Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

아미라 D. Rghei, 브레나 A. Y. 스티븐스, 실비아 P. 토마스, 제이콥 지 이 예이츠는 온타리오 수의대 학생 스티펜스와 온타리오 대학원 장학금을 받았다. 아미라 D. Rghei는 미탁스 가속 학생의 수혜자였다. 이 연구는 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (#66009)과 SKW에 공동 건강 연구 프로젝트 (NSERC 파트너) 보조금 (#433339)에 의해 투자되었다.

1. 세포 스택에 HEK293 세포의 이중 플라스미드 형질
<ol><li>37°C에서 설정된 구슬 목욕에서 HEK293 세포의 저온병을 해동한다. 참고: 세포가 해동하는 동안 37°C로 완전 DMEM을 완전히 따뜻하게 하여 도금시 세포에 충격이 되지 않도록 합니다. 최적의 성장과 트랜스페션 효율을 보장하기 위해 세포가 20개 미만의 낮은 통로 수를 확보하도록 보장합니다. 세포가 마이코플라즈마가 없는 것으로 인증되었...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA.">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li><li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy:+challenges+and+potential+solutions.">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li><li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo.">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li><li>Cathomen, T., Stracker, T. 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F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor.">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li><li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

이 논문에 기재된 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 생산은 분자 생물학 연구 실험실 및 시설의 대부분에서 발견되는 일반적인 재료, 시약 및 장비를 사용합니다. 이 논문은 높은 품질의 시험관 내 및 생체 내 등급 rAAV를 독자에 의해 생성 할 수 있습니다. 무엇보다도, rAAV 생산을 위한 이 프로토콜은 세슘 염화 정제와 관련된 보다 지루한 프로토콜에 비해 효율적이며 초원심분리의 사용을 방지한...

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 이용한 유전자 치료는 지난 3년간1,2에걸쳐 큰 진전을 이루었다. 선천성 실명, 혈우병, 근골격계 및 중추 신경계의 질병을 포함한 다양한 유전질환의 개선을 입증하여 임상 연구3,4의최전선에 AAV 유전자 요법을 도입했다. 2012년, 유럽의약품청(EMA)은 LPL 결핍 의 치료를 위해 지단백질 리파아제(LPL)를 발현하는 AAV1 벡터인 글리베라를 승인하여 유럽 또는 미국에서 유전자 치료 치료를 위한 최초의 마케팅 승인을5. 그 이후, 2개의 추가 AAV 유전자 치료, Luxturna6 및 Zolgensma7는FDA 승인을 수신하고, 시장은 2025년까지 예상되는 10-20의 유전자 치료로 향후 5년 동안 빨리 확장될 것으로 예상됩니다8. 사용 가능한 임상 데이터는 AAV 유전자 치료가 안전하고 잘 용납되며 효과적인 양식으로 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나이며 AAV가 ClinicalTrials.gov 등록한 244개 이상의 임상 시험이 있음을 나타냅니다. AAV 벡터를 포함하는 임상 응용에 대한 관심이 증가함에 따라 대형 동물 모델에서 AAV 치료법의 평가를 용이하게 하기 위해 견고하고 확장 가능한 생산 방법이 필요하며, 이는 번역 파이프라인9에서중요한 단계이기 때문이다.
AAV 벡터 생산을 위해, 두 가지 주요 요구 사항은 AAV 게놈과 캡시드입니다. 야생형(wt)-AAV의 게놈은 길이10에서약 4.7kb인 단일 좌초 DNA이다. wt-AAV 게놈은 게놈의 양끝에서 발견되는 반전된 말단 반복(ItR)을 포함하며, 이는 포장에 중요하며, 담당자 및 캡 유전자(11). 게놈 복제, 바이러스 캡슐화, 바이러스 캡슐화에 필요한 렙 및 캡 유전자는 바이러스 게놈으로부터 제거되고 AAV 벡터생산(12)을위한 트랜스에서 제공된다. 바이러스 게놈에서 이러한 유전자의 제거는 프로모터 및 polyA 신호를 포함하여 치료 간유전자 및 모든 필요한 규제 요소에 대한 공간을 제공합니다. ItR은 적절한 게놈 복제 및 바이러스 캡슐화를 보장하기 위해 벡터 게놈에 남아있다 13,14. 유전자 발현의 역학을 개선하기 위해 AAV 벡터 게놈은 자체 보완적으로 설계되어 AAV 게놈 복제 시 단일 가닥에서 이중 가닥 DNA 변환으로 변환할 필요성을 완화하지만 코딩 용량을 ~2.4 kb15로감소시킨다.
AAV 게놈 설계를 넘어, 캡시드 혈청형 선택은 생체 내 AAV 벡터의 조직 및 세포 트트로피를 결정한다. 조직 트락피즘 이외에, 상이한 AAV 혈청형은 다른 유전자 발현운동학(16)을표시하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Zincarelli외. 17 낮은 발현 혈청형 (AAV2, 3, 4, 5), 적당 한 발현 혈청형 (AAV1, 6, 8), 및 높은 발현 혈청형 (AAV7 및 9)으로 상이한 AAV 혈청형을 분류하였다. 또한 AAV 혈청형을 느린 발병 식(AAV2, 3, 4, 5) 또는 급속 발병 식(AAV1, 6, 7, 8 및 9)으로 분류하였다. 이러한 발산 열대성 및 유전자 발현 운동학은 캡시드 단백질의 아미노산 변이, 캡시드 단백질 형성 및 숙주 세포 수용체/공동 수용체와의 상호작용(18)에기인한다. 일부 AAV 캡시드는 내트라바스 내투여(AAV9)에 이어 혈액-뇌 장벽을 넘거나 내구성이 뛰어난 유전자 발현(AAV6, 6.2FF, 8, 및 9)19,20을위한 장수 근육 세포에 상주하는 능력과 같은 추가적인 유익한특성을갖는다.
이 논문은 전임상 대형 동물 모델에 사용하기 위한 고순도, 하이티터, 연구급 AAV 벡터를 생산하는 비용 효율적인 방법을 자세히 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 AAV의 생산은 세포 스택에서 자란 부착 된 인간 배아 신장 (HEK)293 세포로 이중 플라스미드 형광을 사용하여 달성된다. 더욱이, 연구는 AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 및 DJ21,22를포함하여 헤파린 결합 도메인을 포함하는 AAV 혈청형에 사용될 수 있는 헤파린 황산염 친화성 크로마토그래피 정제를 위한프로토콜을기술한다.
AAV 벡터의 생산에 사용할 수 있는 여러 패키징 시스템이 있습니다. 이 중, Rep 및 Cap 유전자 및 Ad 도우미 유전자(E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 및 VA RNA)가 하나의 플라스미드(pHelper) 내에 포함되는 2-플라스미드 공동 형질 전환 시스템의 사용은 일반적인 3플라스미드(triple) 트랜스포메이션에 비해 몇 가지 실질적인 장점이있으며,23개의플라미드 생산 법, 비용 절감(triple) 트랜스포메이션 에 비해 몇 가지 실질적인 장점이 있다. . 유전자 발현 카세트(pTransgene)를 함유하는 AAV 게놈 플라스미드는 ItR에 의해 측면에 있어야 하며 길이가 ~4.7kb를 초과해서는 안 됩니다. 벡터 티터 및 순도는 형질 전환 시 잠재적인 세포독성 효과로 인해 트랜스진에 의해 영향을 받을 수 있다. 벡터 순도의 평가는 본원에 기재된다. 이 방법을 사용하여 생성된 벡터는 각각 1x10 13 vg/mL을 산출하며, 마우스, 햄스터 및 소 동물 모델에서 평가하였다.
표 1: 필요한 솔루션의 구성. 프로토콜 전체의 다양한 솔루션에 필요한 구성 요소의 백분율 및 볼륨을 포함한 필요한 정보입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 인간을 위해 승인된 3개의 AAV 유전자 치료와 함께 가장 임상적으로 진보된 유전자 치료 벡터 중 하나입니다. AAV에 대한 새로운 응용 프로그램의 임상 발전은 개, 양 및 비인간 영장류를 포함한 더 큰 동물 모델로 마우스와 같은 작은 동물 모델에서 전환하는 것을 포함합니다. 더 큰 동물에 AAV를 투여의 한계 중 하나는 하이 티터 바이러스의 대량에 대한 요구 사항입니다. 서스펜션 세포 배양은 AAV 벡터 생산을 위한 확장 가능한 방법이지만, 장비(예를 들어, 생물반응기)가 있거나 이러한 방식으로 AAV를 생산하는 방법을 아는 연구실이 거의 없습니다. 더욱이, AAV 티터는 부착된 HEK293 세포에 비해 현탁액 HEK 293 세포에서 생산될 때 현저히 낮습니다. 여기에 설명된 셀 스택을 사용하여 다량의 하이티터 AAV를 생산하는 방법이다. AAV를 적발하기 위한 자세한 프로토콜과 벡터 순도 유효성을 검사하는 방법도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 양 모델에서 AAV 매개 된 유전자 발현의 대표적인 결과가 제시된다. 부착 된 세포에서 AAV 벡터의 대규모 생산을위한이 최적화 된 프로토콜은 분자 생물학 실험실이 더 큰 동물 모델에서 새로운 AAV 치료의 테스트를 진행할 수 있게합니다.

작은 설치류 모델에서 더 큰 동물 모델로 의번역및 최종 임상 응용 프로그램은 더 큰 동물을 트랜스포유하고 치료 효과를 달성하는 데 필요한 많은 양의 AAV로 인해 중요한 과제를 제시합니다. 합리적으로 설계된 AAV6.2FF 캡시드의 트랜스듀션 효율을 비교하기 위해, 이전에는 AAV63,마우스, 햄스터 및 양에 비해 뮤린 근육 세포에서 의 연도 효율이 101배 증가하여 인간 단클론 항체(hIg...

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Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 >1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

AAV 바이러스 벡터의 생산을위한이 프로토콜은 비용 효율적이며 전임상, 대형 동물 모델에서 사용하기 위한 고순도, 하이 티터, 연구 급 AAV를 산출합니다. 이 기술은 세포 배양 챔버에서 부착 HEK293 세포를 사용, 이는 시간 효율적이고 덜 실습, 세포에 적은 중단을 허용. 이 프로토콜은 유전자 치료의 분야에 대한 바이러스 벡터 생산에 크게 도움이 될 수 있으며, 또한 헤파란 황산염을 결합하는 다른 AAV 혈청형의 생산에 사용될 수 있다.시작하려면 80%에 도달하면 배양에서 HEK293 세포를 수집합니다. PBS의 3 밀리리터로 세포 배양 판을 부드럽게 세척하기 전에 미디어를 흡인하십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 트립신의 세 밀리리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 플레이트를 2분간 배양합니다. 인큐베이션 후, 트립신을 중화하고, 접시에 완전한 DMEM의 7 밀리리터를 추가하여, 50 밀리리터 원추형 튜브에서 상퍼를 수집합니다. 튜브를 부드럽게 반전하여 세포가 균질한지 확인합니다.세포 밀도를 결정하려면 세포 샘플의 마이크로리터 10개와 트라이팬 블루 10마이크로리터를 혼합합니다. 그리고 셀 카운트 슬라이드에 혼합물을 추가하여 셀 카운터에서 분석한다. 세포 현탁액을 미리 따뜻하게 한 완전 DMEM과 혼합하여 배양 챔버를 볼 수 있습니다.챔버를 부드럽게 회전하여 셀을 균등하게 분배합니다. 챔버를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 배양합니다. 세포 배양챔버 이외에, 10~제4세포에서 제4세포에서 15센티미터 플레이트에서 제곱된 배양세포가 결합을 위한 기준으로 한다.65시간의 인큐베이션 후, 세포가 80~90%의 컨실수일 때, 세포 배양 챔버 포트에 폴리에틸렌-DNA 및 DMEM 혼합물을 천천히 첨가한다. 액체를 모든 행에 균등하게 분배한 후 섭씨 37도, 이산화탄소 는 72시간 동안 5%로 배양됩니다. 인큐베이션 후, 세포 배양실을 격렬하게 흔들어 세포가 흐리게 될 때까지 세포를 빼내고 4~500밀리리터 원심분리관에 붓습니다.18, 000회 G에서 4°C에서 30분간 원심분리로 세포를 펠렛합니다. 1리터 PETG 병에 정제된 상체를 붓고 500밀리리터 원심분리기 튜브에서 50밀리리터의 허가된 완충제에서 셀 펠릿을 재보페수합니다. 37도에서 60분 동안 튜브를 배양합니다.인큐베이션 후, 튜브를 18, 000배 G에서 30분 동안 원심분리하고, 상체를 동일한 1리터 PETG 병으로 옮긴다. 영하 80도에 보관하십시오. 하룻밤 사이에 4도에서 원유 를 해동하십시오.해동되면 0.22 미크론 필터를 사용하여 필터링하십시오. 정화 단계 바로 전에 사용 중인 각 헤파린-세파로즈 컬럼에 대해 4밀리리터의 필터 전처리 버퍼를 추가하여 원심 농축기를 전달합니다. 튜브를 연동 펌프에 놓습니다.솔루션과 미디어를 순차적으로 실행합니다. 튜브에 5 밀리리터 헤파린-세파로즈 컬럼을 부착하고, 기둥을 통해 25밀리리터의 바젤 DMEM을 실행하여 크로마토그래피를 준비합니다. 그런 다음 여과된 원유 의 0.2 마이크로몰라를 초당 1~2방울의 유량으로 컬럼에 로드합니다.마그네슘과 칼슘을 함유한 염화 나트륨 HBSS 300밀리어로 5밀리리터를 순차적으로 세척하고 5개의 elutions를 E1에서 E5로 라벨을 부착합니다. 준비가 되면 전처리 버퍼를 포함하는 원심 농축기를 900회 G에서 2분 동안 회전시합니다. 흐름을 삭제합니다. 원심 농축기 필터를 마그네슘과 칼슘으로 4밀리리터로 2분간 1000회 G로 회전시 세척합니다.그런 다음 원심 농축기에 용출 E2를 추가하고 5 분 동안 1000 회 G에서 회전합니다. 흐름을 삭제합니다. 마찬가지로 농축 된 바이러스가 약 1 밀리리터가 될 때까지 원심 농축기로 용출 E3를 회전시.P200 여과 팁을 사용하여 원심 농축기에서 농축 된 바이러스를 제거하고 멸균 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 바이러스의 수집 후, 마그네슘과 칼슘과 HBSS의 200 마이크로 리터원 원심 농축기를 헹구세요. 파이펫은 30초 동안 힘차게 위아래로 하여 막에 부착된 바이러스를 빼내고, 동일한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 농축 바이러스를 수집한다.튜브를 잘 섞습니다. 4섭씨로 보관하기 전에 기둥을 씻고 20%에탄올로 채점합니다. 펌프 튜빙을 수산화 나트륨 1개에 보관합니다.AAV6.2FF 캡시드의 트랜스듀션 효율은 근내 투여 시 28일 동안 쥐, 햄스터 및 양에서 비교되었다. 마우스는 AAV6.2FF 인간 IgG의 킬로그램당 12번째 벡터 게놈에 5회 투여, 혈청에서 인간 IgG의 밀리리터 당 171 에서 237 마이크로그램 사이에 발현하였다. 햄스터는 AAV6.2FF 인간 IgG의 킬로그램 당 13 벡터 게놈에 2회 10에서 투여되며, 마우스보다 훨씬 높은 수준의 인간 IgG를 발현한다.대형 동물 모델은 플라즈마에서 인간 IgG 수준의 밀리리터 당 평균 35 마이크로그램을 표현할 수 있었습니다. 대형 동물 모델은 생체 내에서 AAV 트랜스진의 발현을 결정하고, 전간유전자가 관심 있는 장애 또는 질병에 대한 치료 효과가 있는지 를 결정할 수 있다. 이 연구는 AAV6.2FF의 뛰어난 트랜스듀션 능력, 골격 근육의 새로운 AAV 6 세로형 벡터, 생체내 AAV 바이러스 벡터의 낮은 면역원성을 선보였다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...