Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Амира Д. Ргей, Бренна А. Й. Стивенс, Сильвия. Томас и Джейкоб Г. Э. Йейтс были получателями стипендий для студентов ветеринарного колледжа Онтарио, а также стипендий для выпускников Онтарио. Амира Д. Ргей была удостоена премии Mitacs Accelerate Studentship. Эта работа финансировалась грантом Проекта Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) (#66009) и грантом совместных исследовательских проектов в области здравоохранения (NSERC partnered) (#433339) для SKW.

1. Двойная плазмидная трансфекция клеток HEK293 в клеточных стеках
<ol><li>Разморозить криоканец клеток HEK293 в бисерной ванне при температуре 37 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте полный DMEM до 37 ° C, пока ячейки оттаивают, чтобы гарантировать, что холодная температура не ударяет ячейки пр...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA.">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li><li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy:+challenges+and+potential+solutions.">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li><li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo.">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li><li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus.">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor.">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li><li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

Производство рекомбинантных векторов AAV (rAAV), описанных в этой статье, использует общие материалы, реагенты и оборудование, найденные в большинстве исследовательских лабораторий и объектов молекулярной биологии. Эта статья позволяет читателю производить высококачественные rAAV in vitro<...

Генная терапия с использованием векторов аденоассоциированного вируса (AAV) добилась огромных успехов за последние три десятилетия1,2. Продемонстрированные улучшения в различных генетических заболеваниях, включая врожденную слепоту, гемофилию и заболевания опорно-двигательного аппарата и центральной нервной системы, вывели генную терапию AAV на передний план клинических исследований3,4. В 2012 году Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) одобрило Glybera, вектор AAV1, экспрессирующий липопротеинлипазу (LPL) для лечения дефицита LPL, что делает его первым маркетинговым разрешением на лечение генной терапией в Европе или Соединенных Штатах5. С тех пор две дополнительные генные терапии AAV, Luxturna6 и Zolgensma7,получили одобрение FDA, и ожидается, что рынок будет быстро расширяться в течение следующих 5 лет с 10-20 генными терапиями, ожидаемыми к 2025году 8. Имеющиеся клинические данные свидетельствуют о том, что генная терапия AAV является безопасным, хорошо переносимым и эффективным методом, что делает ее одним из наиболее перспективных вирусных векторов, с более чем 244 клиническими испытаниями с участием AAV, зарегистрированных с ClinicalTrials.gov. Растущий интерес к клиническим применениям, связанным с векторами AAV, требует надежных и масштабируемых методов производства для облегчения оценки AAV-терапии на крупных животных моделях, поскольку это критический шаг в трансляционном конвейере9.
Для производства векторов AAV двумя основными требованиями являются геном AAV и капсид. Геном дикого типа (wt)-AAV представляет собой одноцепочечную ДНК длиной примерно 4,7 кб10. Геном wt-AAV содержит перевернутые концевые повторы (ITR), обнаруженные на обоих концах генома, которые важны для упаковки, и гены rep и cap 11. Гены rep и cap, необходимые для репликации генома, сборки вирусного капсида и инкапсуляции генома в вирусный капсид, удаляются из вирусного генома и предоставляются в транс для AAV векторной продукции12. Удаление этих генов из вирусного генома обеспечивает место для терапевтических трансгенов и всех необходимых регуляторных элементов, включая промотор и полиА-сигнал. РМЭ остаются в векторном геноме для обеспечения надлежащей репликации генома и вирусной инкапсуляции13,14. Чтобы улучшить кинетику экспрессии трансгенов, векторные геномы AAV могут быть спроектированы так, чтобы быть самокомплементарными, что смягчает необходимость преобразования из одноцепочечного в двухцепочечное преобразование ДНК во время репликации генома AAV, но снижает способность кодирования до ~ 2,4 кб15.
Помимо проектирования генома AAV, выбор серотипа капсида определяет тканевый и клеточный тропизм вектора AAV in vivo2. В дополнение к тканевому тропизму, было показано, что различные серотипы AAV демонстрируют различную кинетику экспрессии генов16. Например, Zincarelli et al.17 классифицировали различные серотипы AAV на серотипы с низкой экспрессией (AAV2, 3, 4, 5), серотипы умеренной экспрессии (AAV1, 6, 8) и серотипы с высокой экспрессией (AAV7 и 9). Они также классифицировали серотипы AAV на экспрессию с медленным началом (AAV2, 3, 4, 5) или экспрессию с быстрым началом (AAV1, 6, 7, 8 и 9). Эти расходящиеся тропизмы и кинетика экспрессии генов обусловлены аминокислотными вариациями в белках капсида, образованиях капсидного белка и взаимодействиях с рецепторами/корецепторами клеток-хозяев18. Некоторые капсиды AAV имеют дополнительные полезные характеристики, такие как способность пересекать гематоэнцефалический барьер после внутрисосудистого введения (AAV9) или находиться в долгоживущих мышечных клетках для длительной экспрессии трансгенов (AAV6, 6.2FF, 8 и 9)19,20.
Целью данной статьи является подробное описание экономически эффективного метода получения высокочистых, высокотитерных, исследовательских векторов AAV для использования в доклинических моделях крупных животных. Производство AAV с использованием этого протокола достигается с помощью двойной плазмидной трансфекции в адгезивные клетки эмбриональной почки человека (HEK)293, выращенные в клеточных стеках. Кроме того, в исследовании описан протокол очистки аффинной хроматографии гепарина сульфата, который может быть использован для серотипов AAV, содержащих гепаринсвязывающие домены, включая AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 и DJ21,22.
Для производства векторов AAV доступен ряд упаковочных систем. Среди них использование двухплазмидных котрансфекционных систем, в которых гены Rep и Cap и гены ad-хелпера (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 и VA РНК) содержатся в одной плазмиде (pHelper), имеет некоторые практические преимущества перед распространенным трехплазмидным (тройным) методом трансфекции, включая снижение затрат на производство плазмид23,24 . Плазмида генома AAV, содержащая кассету экспрессии трансгена (pTransgene), должна быть окружена ITR и не должна превышать ~4,7 кб в длину. Векторный титр и чистота могут быть затронуты трансгеном из-за потенциальных цитотоксических эффектов во время трансфекции. Оценка чистоты векторов описана в настоящем документе. Векторы, полученные с использованием этого метода, которые дают 1 x 1013 vg / mL для каждого, были оценены на моделях мышей, хомяков и овец.
Таблица 1: Состав требуемых растворов. Необходимая информация, включая проценты и объемы, компонентов, необходимых для различных решений по всему протоколу. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

Векторы аденоассоциированного вируса (AAV) являются одними из наиболее клинически продвинутых векторов генной терапии, причем три генные терапии AAV одобрены для людей. Клиническое продвижение новых приложений для AAV включает переход от моделей мелких животных, таких как мыши, к более крупным животным моделям, включая собак, овец и нечеловеческих приматов. Одним из ограничений введения AAV более крупным животным является потребность в больших количествах вируса с высоким титром. В то время как культура суспензионных клеток является масштабируемым методом для производства векторов AAV, немногие исследовательские лаборатории имеют оборудование (например, биореакторы) или знают, как производить AAV таким образом. Кроме того, титры AAV часто значительно ниже при производстве в клетках суспензии HEK 293 по сравнению с адгезивными клетками HEK293. Здесь описан способ получения больших количеств высокотитерных AAV с использованием клеточных стеков. Также описан подробный протокол титрования AAV, а также методы проверки чистоты векторов. Наконец, представлены репрезентативные результаты экспрессии трансгенов, опосредованной AAV, в модели овец. Этот оптимизированный протокол для крупномасштабного производства векторов AAV в адгезивных клетках позволит лабораториям молекулярной биологии продвигать тестирование своих новых методов AAV-терапии на более крупных животных моделях.

Перевод с моделей мелких грызунов на более крупные модели животных и возможное клиническое применение представляет собой значительную проблему из-за большого количества AAV, необходимого для передачи более крупных животных и достижения терапевтических эффектов. Чтобы сравнить эффект...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Здесь мы предоставляем подробную процедуру крупномасштабного производства векторов AAV исследовательского класса с использованием адгезивных клеток HEK 293, выращенных в клеточных стеках, и аффинной хроматографической очистки. Этот протокол последовательно дает >1 x 1013 векторных геномов / мл, обеспечивая векторные количества, подходящие для исследований на крупных животных.

Производство аденоассоциированных вирусных векторов в клеточных стеках для доклинических исследований на крупных животных моделях

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Этот протокол для производства вирусных векторов AAV является экономически эффективным и дает высокую чистоту, высокий титр, исследовательский класс AAV для использования в доклинических, крупных животных моделях. Этот метод использует адгезивные клетки HEK293 в камерах клеточной культуры, что экономит время и менее практично, что позволяет уменьшить количество сбоев в клетках. Этот протокол может значительно помочь в производстве вирусных векторов для области генной терапии, а также может быть использован для производства других серотипов AAV, которые также связывают сульфат гепарана.Для начала соберите клетки HEK293 из культуры, когда она достигнет 80% конфлюентности. Аспирируйте среду перед аккуратной промывкой пластины культуры клеток тремя миллилитрами PBS. Затем аспирировать PBS и добавить три миллилитра трипсина.Инкубируйте пластины в течение двух минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации нейтрализуют трипсин, добавив семь миллилитров полного DMEM в пластину, и собирают супернатант в конические трубки по 50 миллилитров. Осторожно переверните трубки, чтобы убедиться, что клетки однородны.Чтобы определить плотность клеток, смешайте 10 микролитров образцов клеток с 10 микролитрами трипан-синего цвета. И добавьте смесь на слайд подсчета клеток для анализа в счетчике клеток. Смешайте клеточную суспензию с одним литром предварительно нагретого полного DMEM, чтобы увидеть культуральную камеру.Осторожно поверните камеру, чтобы равномерно распределить ячейки. Инкубируйте камеру при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. В дополнение к камере культивирования клеток, культивируемые клетки от 10 до четвертых клеток на сантиметр в квадрате в 15-сантиметровой пластине в качестве эталона для слияния.После 65 часов инкубации, когда клетки на 80-90% сливаются, медленно добавляют смесь полиэтиленимин-ДНК и DMEM в порт камеры клеточной культуры. Распределите жидкость равномерно по всем рядам перед инкубацией при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72 часов. После инкубации энергично встряхните камеру клеточной культуры, чтобы выбить клетки, пока среда не станет мутной, и разлейте ее в четыре или 500-миллилитровые центрифужные трубки.Гранулируют клетки центрифугированием при 18 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Налейте осветленный супернатант в литровую бутылку PETG и повторно суспендируйте гранулы ячейки в 50 миллилитрах лицензированного буфера в 500-миллилитровых центрифужных трубках. Инкубировать пробирки в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия.После инкубации центрифугируют пробирки по 18 000 раз G в течение 30 минут и переносят супернатант в ту же литровую бутылку PETG. Хранить при минус 80 градусах Цельсия. Разморозьте сырой лизат при четырех градусах Цельсия за ночь.После размораживания отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 микрона. Непосредственно перед этапами очистки пассивируют центробежный концентратор, добавляя четыре миллилитра буфера предварительной обработки фильтра для каждой используемой колонны гепарин-сефарозы. Поместите трубку в перистальтический насос.Последовательно запускайте решения и носители. Подготовьтесь к хроматографии, присоединив пятимиллилитровую колонку гепарина-сефароза к трубке и пропустив 25 миллилитров Bazell DMEM через колонку. Затем загрузите 0,2 микромоляра отфильтрованного сырого лизата на колонну со скоростью потока от одной до двух капель в секунду.Вымойте колонку последовательно, чтобы элюировать пять миллилитров пять раз с 300 миллимоларами хлорида натрия HBSS, с магнием и кальцием, и пометьте пять элюций как E1 до E5. Когда все будет готово, вращайте центробежный концентратор, содержащий буфер предварительной обработки, в 900 раз больше G в течение двух минут. Отбросьте сквозной поток. Промыть фильтр центробежного концентратора четырьмя миллилитрами HBSS магнием и кальцием, вращая в 1000 раз G в течение двух минут.Затем добавьте элюирование E2 к центробежному концентратору и вращайте в 1000 раз G в течение пяти минут. Отбросьте сквозной поток. Аналогично вращайте элюирование E3 в центробежный концентратор до тех пор, пока концентрированный вирус не достигнет примерно одного миллилитра.Удалите концентрированный вирус из центробежного концентратора с помощью фильтрованного наконечника P200 и соберите его в стерильную 1,5-миллилитрную центрифужную трубку. После сбора вируса промыть центробежный концентратор 200 микролитрами HBSS магнием и кальцием. Пипетка энергично поднимается и опускается в течение 30 секунд, чтобы выбить любой вирус, прилипший к мембране, и собрать концентрированный вирус в ту же 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.Хорошо перемешайте трубку. Вымойте колонну и насытите 20% этанолом перед хранением при четырех градусах Цельсия. Храните насосную трубку в одном молярном гидроксиде натрия.Эффективность трансдукции капсида AAV6.2FF сравнивали у мышей, хомяков и ягнят в течение 28 дней после внутримышечного введения. Мышам вводили пять раз от 10 до 12-го векторного генома на килограмм AAV6.2FF человеческого IgG, экспрессируемого от 171 до 237 микрограммов на миллилитр человеческого IgG в сыворотке крови. Хомяку вводят два раза по 10 до 13-го вектора геномов на килограмм AAV6.2FF человеческого IgG, экспрессируемого гораздо более высоким уровнем человеческого IgG, чем у мышей.В то время как модель крупного животного смогла выразить в среднем 35 микрограммов на миллилитр уровня IgG человека в плазме. Крупные животные модели могут определять экспрессию трансгена AAV in vivo и определять, оказывают ли трансгены терапевтический эффект против расстройства или заболевания, представляющего интерес. Исследование продемонстрировало отличную трансдукционную способность AAV6.2FF, нового вектора серотипа AAV 6 в скелетных мышцах, а также низкую иммуногенность вирусных векторов AAV in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Оценка Цены Вирус Производство в водных системах

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Инженерные и эволюции Синтетическая адено-связанный вирус (AAV) генной терапии векторы с помощью ДНК семьи Перетасовка

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Биолюминесценция Визуализация активности NADPH оксидазы на различных животных моделях

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Исследования вирусов гриппа A в мышиной модели инфекции

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Сбор и обработка лимфатических узлов от крупных животных для анализа РНК: подготовка исследований транскриптомики Лимфоузел крупных видов животных

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...