Name: production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas och Jacob G. E. Yates var mottagare av Ontario Veterinary College Student Stipends samt Ontario Graduate Scholarships. Amira D. Rghei var mottagare av ett Mitacs Accelerate Studentship. Detta arbete finansierades av Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) och ett Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) anslag (#433339) till SKW.

1. Dubbel plasmidtransfektion av HEK293-celler i cellstaplar
<ol><li>Tina en kryoflaska hek293 celler i ett pärlbad som är inställt på 37 °C. OBS: Förvärmd komplett DMEM till 37 °C medan cellerna tinar för att säkerställa att den kalla temperaturen inte chockar cellerna vid plätering. Se till att cellerna har ett lågt passagenummer, helst mindre än 20, för att säkerställa optimal tillväxt och transfekteringseffektivitet. Se till att cellerna är certifierade för att vara mykoplasmafria.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+at+50:+A+golden+anniversary+of+discovery,+research,+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective.">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B.">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li><li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies.">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li><li>Yl&#228;-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020)</li><li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020)</li><li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020)</li><li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAV+vector+toolkit:+poised+at+the+clinical+crossroads.">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li><li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus:+chemical+and+physical+studies.">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li><li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA.">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li><li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy:+challenges+and+potential+solutions.">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li><li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo.">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li><li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus.">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor.">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li><li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier;+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells.">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li><li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice.">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li><li>Liu, J., Moon, Y. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression.">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996)</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+4+(AAV4)+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity.">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).</li></ol>

Produktionen av rekombinanta AAV (rAAV) vektorer som beskrivs i detta dokument använder vanliga material, reagenser och utrustning som finns i majoriteten av molekylärbiologiska forskningslaboratorier och anläggningar. Detta dokument gör det möjligt att producera högkvalitativ in vitro och in vivo grade rAAV av läsaren. Framför allt är detta protokoll för rAAV-produktion, jämfört med mer tråkiga protokoll som involverar cesiumkloridrening, effektivt och undviker användning av ultracentrifu...

Genterapi med hjälp av adenoassocierade virusvektorer (AAV) har gjort stora framsteg under de senaste tre decennierna1,2. Visade förbättringar i ett brett spektrum av genetiska sjukdomar, inklusive medfödd blindhet, hemofili och sjukdomar i muskuloskeletala och centrala nervsystemet, har fört AAV-genterapi till framkanten av klinisk forskning3,4. År 2012 godkände Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) Glybera, en AAV1-vektor som uttrycker lipoproteinlilätas (LPL) för behandling av LPL-brist, vilket gör det till det första godkännandet för försäljning för en genterapibehandling i antingen Europa eller USA5. Sedan dess har ytterligare två AAV-genterapier, Luxturna6 och Zolgensma7, fått FDA-godkännande, och marknaden förväntas expandera snabbt under de kommande 5 åren med så många som 10-20 genterapier som förväntas 20258. Tillgängliga kliniska data tyder på att AAV genterapi är en säker, väl tolererad och effektiv modalitet vilket gör det till en av de mest lovande virala vektorerna, med över 244 kliniska prövningar med AAV registrerade med ClinicalTrials.gov. Det ökande intresset för kliniska tillämpningar som involverar AAV-vektorer kräver robusta och skalbara produktionsmetoder för att underlätta utvärderingen av AAV-terapier i stora djurmodeller, eftersom detta är ett kritiskt steg i translationell pipeline9.
För AAV-vektorproduktion är de två huvudkraven AAV-genomet och kapsiden. Genomet av vildtyp (wt)-AAV är enkelsträngat DNA som är ungefär 4,7 kb i längd10. Wt-AAV-genomet består av inverterade terminalrepetitioner (ITR) som finns i båda ändarna av genomet, som är viktiga för förpackningen, och rep- och capgenerna 11. Rep- och kapsegenerna, som är nödvändiga för genomreplikering, montering av viruskapslar och inkapsling av genomet i viruskapsiden, avlägsnas från virusgenomet och tillhandahålls i trans för AAV-vektorproduktion12. Avlägsnandet av dessa gener från virusgenomet ger utrymme för terapeutiska transgener och alla nödvändiga regulatoriska element, inklusive promotorn och polyA-signalen. ITR:erna finns kvar i vektorgenomet för att säkerställa korrekt genomreplikation och viral inkapsling13,14. För att förbättra kinetiken hos transgeneuttryck kan AAV-vektorgenom konstrueras för att vara självkompilerande, vilket minskar behovet av konvertering från enkelsträngad till dubbelsträngad DNA-konvertering under AAV-genomreplikering, men minskar kodningskapaciteten till ~ 2,4 kb15.
Utöver AAV-genomdesign bestämmer capsid serotypval vävnaden och celltropismen hos AAV-vektorn in vivo2. Förutom vävnadstropism har olika AAV-serotyper visat sig visa olika genuttryck kinetik16. Till exempel klassificerade Zincarelli et al.17 olika AAV-serotyper i serotyper med lågt uttryck (AAV2, 3, 4, 5), serotyper med måttliga uttryck (AAV1, 6, 8) och serotyper med högt uttryck (AAV7 och 9). De kategoriserade också AAV serotyper i långsam-debut uttryck (AAV2, 3, 4, 5) eller snabb-debut uttryck (AAV1, 6, 7, 8 och 9). Dessa divergerande tromatismer och genuttryckskinetik beror på aminosyravariationer i kapsidproteinerna, kapsidproteinformationer och interaktioner med värdcellreceptorer/co-receptorer18. Vissa AAV-kapsysider har ytterligare fördelaktiga egenskaper som förmågan att korsa blod - hjärnbarriären efter intravaskulär administrering (AAV9) eller bor i långvariga muskelceller för hållbart transgenuttryck (AAV6, 6.2FF, 8 och 9)19,20.
Detta dokument syftar till att beskriva en kostnadseffektiv metod för att producera hög renhet, hög-titer, forskningsklass AAV vektorer för användning i prekliniska stora djurmodeller. Produktion av AAV med hjälp av detta protokoll uppnås med hjälp av dual-plasmid transfection till vidhäftande mänskliga embryonala njurar (HEK)293 celler odlade i cell stackar. Dessutom beskriver studien ett protokoll för heparinsulfat affinitetskromatografirening, som kan användas för AAV-serotyper som innehåller heparinbindande domäner, inklusive AAV2, 3, 6, 6,2FF, 13 och DJ21,22.
Ett antal förpackningssystem finns tillgängliga för produktion av AAV-vektorer. Bland dessa har användningen av ett tvåplasmid-co-transfection-system, där Rep- och Cap-generna och Ad helper-generna (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 och VA RNA) finns i en plasmid (pHelper), vissa praktiska fördelar jämfört med den gemensamma treplasmidtransfektionsmetoden, inklusive minskad kostnad för plasmidproduktion23,24 . AAV-genomplasmiden som innehåller transgeneuttryckskassetten (pTransgene) får flankeras av ITR och får inte överstiga ~4,7 kb i längd. Vektortiter och renhet kan påverkas av transgenet på grund av potentiella cytotoxiska effekter under transfektion. Bedömning av vektor renhet beskrivs häri. Vektorer som produceras med denna metod, som ger en 1 x 1013 vg/mL för varje, utvärderades i möss, hamstrar och fårdjur modeller.
Tabell 1: Sammansättning av nödvändiga lösningar. Nödvändig information, inklusive procentsatser och volymer, av komponenter som behövs för olika lösningar i hela protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SM2001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A399-4</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 chamber cellstack</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L PETG bottle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>FS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue Clean up Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>7000232</td>
			<td>15 cm plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955240</td>
			<td>50 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Greenfield</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH302268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer&#8217;s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>F650S</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sulfate column</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KC34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431124</td>
			<td>Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431123-6EA</td>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP35810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem, reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Sterilize prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Dilute to 1x for use on cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet basin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-681-502</td>
			<td>Purchase sterile pipet basins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Follow manufacturer&#8217;s instructions to produce a 1L solution. 0.22&#956;m filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene semi-skirted PCR Plate</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>WS-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>CAUTION. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>10600023</td>
			<td>Use forceps to manipulate. Wear gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>65158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM008-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTrangene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from plasmid repository</td>
			<td>NA</td>
			<td>Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-96440-14</td>
			<td>Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Use at 10x concentration in protocol from section 4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>Cygnus Technologies</td>
			<td>I700</td>
			<td>Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody, HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G-21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0033B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28312</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV40 polyA primer probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15524010</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC810024</td>
			<td>Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Nuclease for cell lysis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal qPCR master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M3003L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAUTION:&#160;Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of adeno-associated virus vectors in cell stacks for preclinical studies in large animal models

Adeno-associerade virus (AAV) vektorer är bland de mest kliniskt avancerade genterapi vektorer, med tre AAV genterapier godkända för människor. Klinisk utveckling av nya tillämpningar för AAV innebär övergång från små djurmodeller, såsom möss, till större djurmodeller, inklusive hundar, får och icke-mänskliga primater. En av begränsningarna med att administrera AAV till större djur är kravet på stora mängder högtitervirus. Medan suspension cell kultur är en skalbar metod för AAV vektorproduktion, har få forskningslaboratorier utrustningen (t.ex. bioreaktorer) eller vet hur man producerar AAV på detta sätt. Dessutom är AAV-titers ofta betydligt lägre när de produceras i suspension HEK 293 celler jämfört med vidhäftande HEK293 celler. Beskrivs här är en metod för att producera stora mängder hög-titer AAV med hjälp av cellstackar. Ett detaljerat protokoll för titering AAV samt metoder för validering av vektor renhet beskrivs också. Slutligen presenteras representativa resultat av AAV-medierade transgene uttryck i en fårmodell. Detta optimerade protokoll för storskalig produktion av AAV-vektorer i vidhäftande celler kommer att göra det möjligt för molekylärbiologiska laboratorier att främja testningen av sina nya AAV-terapier i större djurmodeller.

Översättning från små gnagare modeller till större djurmodeller och eventuell klinisk tillämpning utgör en betydande utmaning på grund av den stora mängd AAV som krävs för att omvandla större djur och uppnå terapeutiska effekter. För att jämföra transduktionseffektiviteten hos den rationellt utformade AAV6.2FF capsid, tidigare visat en 101-faldig ökning av transduktion effektivitet i murin muskelceller jämfört med AAV63, möss, hamstrar och lamm administrerades alla AAV6.2FF utt...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models at JoVE.com

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Här tillhandahåller vi ett detaljerat förfarande för storskalig produktion av AAV-vektorer av forskningskvalitet med hjälp av vidhäftande HEK 293-celler odlade i cellstackar och affinitetskromatografirening. Detta protokoll ger konsekvent >1 x 1013 vektorgenom/ml, vilket ger vektorkvantiteter som är lämpliga för stora djurstudier.

Produktion av Adeno-associerade virusvektorer i cellstackar för prekliniska studier i stora djurmodeller

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Detta protokoll för produktion av AAV-virusvektorer är kostnadseffektivt och ger hög renhet, hög titer, forskningsklass AAV för användning i prekliniska, stora djurmodeller. Denna teknik använder vidhäftande HEK293-celler i cellodlingskammare, vilket är tidseffektivt och mindre praktiskt, vilket möjliggör färre störningar i cellerna. Detta protokoll kan i hög grad stödja i viral vektorproduktion för genterapi, och kan också användas för produktion av andra AAV serotyper som också binder heparansulfat.Till att börja med samlar du HEK293-celler från kulturen när den når 80% sammanflöde. Aspirera på mediet innan du försiktigt tvättar cellodlingsplattan med tre milliliter PBS. Aspirera sedan PBS och tillsätt tre milliliter trypsin.Inkubera plattorna i två minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubation neutraliserar du trypsin genom att tillsätta sju milliliter komplett DMEM till plattan och samla supernatanten i 50 milliliter koniska rör. Vänd försiktigt in rören för att säkerställa att cellerna är homogena.För att bestämma celltätheten, blanda 10 mikroliter av cellproverna med 10 mikroliter trypanblått. Och tillsätt blandningen i en cellräkningsbild för att analysera i cellräknaren. Blanda cellfjädringen med en liter förvärmd komplett DMEM för att se kulturkammaren.Rotera försiktigt kammaren för att fördela cellerna jämnt. Inkubera kammaren vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Förutom cellodlingskammaren, kulturceller vid 10 till de fjärde cellerna per centimeter i kvadrat i en 15 centimeter platta som referens för sammanflöde.Efter 65 timmars inkubation, när cellerna är 80 till 90%sammanflöde, tillsätt långsamt polyeteneimin-DNA och DMEM-blandningen i cellodlingskammarens port. Fördela vätskan jämnt till alla rader innan du inkuberar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 72 timmar. Efter inkubation skakar du cellodlingskammaren kraftigt för att lossa cellerna tills mediet verkar grumligt och häll det i fyra eller 500 milliliter centrifugrör.Pellet cellerna genom centrifugering vid 18 000 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Häll det klarnade supernatanten i en enliters PETG-flaska och återanvänd cellpelletsen i 50 milliliter licensierad buffert i 500 ml centrifugrör. Inkubera rören i 60 minuter vid 37 grader Celsius.Efter inkubation, centrifugera rören vid 18 000 gånger G i 30 minuter och överför supernatanten till samma enliters PETG-flaska. Förvara på minus 80 grader Celsius. Tina den råa lysat vid fyra grader Celsius över natten.När den har tinats filtrerar du den med ett 0,22 mikronfilter. Omedelbart före reningsstegen, passivera centrifugalkoncentratorn genom att tillsätta fyra milliliter filterförbehandlingsbuffert för varje heparin-Sepharose-kolonn som används. Placera slangen i en peristaltisk pump.Sekventiellt driva lösningar och media. Förbered för kromatografi genom att fästa en fem milliliter heparin-Sepharose-kolonn på slangen och kör 25 milliliter Bazell DMEM genom kolonnen. Ladda sedan 0,2 mikromolar av den filtrerade råa lysat på kolonnen med en flödeshastighet på en till två droppar per sekund.Tvätta kolonnen sekventiellt för att gäcka fem milliliter fem gånger med 300 millimolar natriumklorid HBSS, med magnesium och kalcium, och märk de fem eleutionerna som E1 till E5. När du är klar, snurra centrifugalkoncentratorn som innehåller förbehandlingsbufferten vid 900 gånger G i två minuter. Kassera genomströmningen. Tvätta centrifugalkoncentratorfiltret med fyra milliliter HBSS med magnesium och kalcium genom att snurra vid 1000 gånger G i två minuter.Tillsätt sedan elution E2 i centrifugalkoncentratorn och snurra vid 1000 gånger G i fem minuter. Kassera genomströmningen. Snurra på samma sätt elution E3 i centrifugalkoncentratorn tills det koncentrerade viruset är ungefär en milliliter.Ta bort det koncentrerade viruset från centrifugalkoncentratorn med en P200-filtrerad spets och samla det i ett sterilt 1,5 ml centrifugrör. Skölj centrifugalkoncentratorn med 200 mikroliter HBSS med magnesium och kalcium efter insamling av viruset. Pipettera upp och ner kraftigt i 30 sekunder för att lossa något virus som fastnat vid membranet och samla det koncentrerade viruset i samma 1,5 milliliter centrifugrör.Blanda röret väl. Tvätta kolonnen och mätta med 20% etanol innan du lagrar vid fyra grader Celsius. Förvara pumpslangen i en molar natriumhydroxid.Givarens effektivitet av AAV6.2FF kapsysid jämfördes hos möss, hamstrar och lamm i 28 dagar vid intramuskulär administrering. Möss administrerade fem gånger 10 till 12: e vektorgenom per kilo av AAV6.2FF human IgG, uttryckt mellan 171 och 237 mikrogram per milliliter mänsklig IgG i serumet. Hamster administreras vid två gånger 10 till 13: e vektorgenom per kilo AAV6.2FF human IgG, uttryckt mycket högre nivåer av mänsklig IgG än mössen.Medan den stora djurmodellen kunde uttrycka i genomsnitt 35 mikrogram per milliliter av mänskliga IgG-nivåer i plasma. Stora djurmodeller kan bestämma uttrycket av AAV-transgenen in vivo och avgöra om transgenerna har terapeutisk effekt mot störningen eller sjukdomen av intresse. Studien har visat den stora transduktionsförmågan hos AAV6.2FF, en ny AAV 6 serotyp vektor i skelettmuskulaturen, liksom den låga immunogeniciteten hos AAV viral vektorer in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Uppskatta priser Virus Produktion i akvatiska system

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering och evolution av syntetisk Adeno-associerat virus (AAV) Gene Therapy Vektorer via DNA Familj Skyffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Bioluminescens Avbildning av NADPH-oxidas aktivitet i olika djurmodeller

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Insamling och bearbetning av lymfkörtlar från stora djur för RNA analys: förbereda för lymfkörtel Transcriptomic studier av stora djurarter

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...