Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom NSF Major Research Instrument-Mechanismus unter den Fördernummern 1626093 und 1919583 unterstützt.

HINWEIS: Alle Mediumsvorbereitungs- und Zellkulturtechniken werden unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung einer Biosicherheitswerkbank mit laminarer Strömung durchgeführt. Alle beschriebenen Kulturinkubationsschritte werden mit einem Inkubator durchgeführt, der eine Atmosphäre von 37 °C, 5%CO2und 95% Luftfeuchtigkeit aufrechterhält.
1. Zellkultur
<ol><li>Vorbereitung des Wachstumsmediums<ol>
<li>Für MSC und LADMAC fügen Sie 50 ml FBS und 5 ml 100x Antibiotikum / An...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

Die Analyse der Phagozytose unter Verwendung von Biopartikeln, die an einen pH-empfindlichen Farbstoff konjugiert sind, ist ein relativ neues Werkzeug, das sich gegenüber herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln als vorteilhaft erwiesen hat12,19,20. Bei herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln ist nur eine Endpunktanalyse möglich. Der Nachweis erfolgt mit Fluoreszenzmikroskopie und/oder Spektrofluorometrie nach dem...

Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind Vorläuferzellen, aus denen Bindegewebszellen entstehen. MSC sind in adulten Säugetiergeweben vorhanden und können aus dem Knochenmark isoliert werden1. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften werden diese Zellen umfassend untersucht2. Frühe Studien konzentrierten sich auf die MSC-Regulation von T-Zellen3,4,5,6, aber in jüngerer Zeit hat ihre Regulation von Makrophagenzellen (MΦ), einer wichtigen zellulären Komponente der angeborenen Immunität, erhöhte Aufmerksamkeit erhalten7,8,9,10,11,12,13,14 . Die Bedeutung der MSC-MΦ-Interaktion bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die Depletion von Monozyten/Makrophagen die therapeutischen Wirkungen von MSC in Tiermodellenaufhebt 8. Hier liegt der Fokus auf der Zellkontakt-Interaktion des MSC mit MΦ. MSC haben die Fähigkeit, den Phänotyp von MΦ zu regulieren, indem sie den Wechsel von entzündlichen zu entzündungshemmenden Reaktionen fördern, was zu Gewebereparaturaktivitätenführt 8,9,10,11, und es wurde viel getan, um diese Regulationsmechanismen zu demonstrieren. Unter anderen Umständen kann MSC eine MΦ-getriebene Entzündungsreaktion12,13 unterstützen oder verschlimmern und die phagozytische Aktivität von MΦverbessern 14,15. Es besteht jedoch ein kritischer Mangel an vorhandenen Daten, die die Mechanismen und die Bedingungen identifizieren, unter denen MSC die phagozytische Aktivität von MΦ regulieren.
MΦ haben Familien von Rezeptoren, die entweder opsonisierte (Antikörper oder Komplement-beschichtete) oder nicht-opsonisierte Pathogene erkennen, die zu Phagozytose führen16. Die Aktivierung und Aktivität der letzteren ist weniger gut untersucht17. In einer nicht-entzündlichen In-vitro-Umgebung verstärken MSC die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Krankheitserregern13. Die Erkennung von nicht-opsonisierten Krankheitserregern durch MΦ kann jedoch nach Exposition gegenüber einer entzündlichen Umgebung, die von Lymphozyten während einer adaptiven Immunantwort produziert wird, reduziert werden. IFN-γ, das von natürlichen Killerzellen und Effektor-Lymphozyten freigesetzt wird, hat eine hemmende Wirkung auf die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Partikeln18. Ein Kokulturmodell wurde entwickelt, um die Mechanismen der MSC-Direktkontaktregulation der MΦ-Phagozytose zu untersuchen. Ziel des hier vorgestellten Experiments ist es, festzustellen, ob MSC die MΦ-Phagozytose von nicht-opsonisierten Erregern regulieren, nachdem MΦ IFN-γ ausgesetzt wurde (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

Mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden traditionell auf ihre regenerativen Eigenschaften untersucht, aber in jüngster Zeit standen ihre immunregulatorischen Eigenschaften im Vordergrund. Sie interagieren mit und regulieren die Aktivität von Immunzellen. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der MSC-Regulation der phagozytären Aktivität von Makrophagen. Makrophagen (MΦ) Phagozytose ist ein wichtiger Teil der angeborenen Reaktion des Immunsystems auf infektionen, und die Mechanismen, durch die MSC diese Reaktion modulieren, werden aktiv untersucht. Hier wird eine Methode zur Untersuchung der MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Zymosanpartikeln vorgestellt, die in Kokultur mit MSC zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind. Wenn die phagozytische Aktivität zunimmt und die markierten Zymosanpartikel in der sauren Umgebung des Phagolysosoms eingeschlossen sind, erhöht sich die Fluoreszenzintensität des pH-empfindlichen Moleküls. Mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen wird die phagozytische Aktivität mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen und kinetische Daten werden als Änderungen der relativen Fluoreszenzeinheiten über einen Zeitraum von 70 Minuten dargestellt. Um diese quantitativen Daten zu unterstützen, wird die Veränderung der phagozytischen Aktivität mittels dynamischer Bildgebung visualisiert. Die Ergebnisse dieser Methode zeigen, dass MSC in Kokultur die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisiertem Zymosan sowohl von naivem als auch von IFN-γ MΦ verbessert. Diese Daten ergänzen das aktuelle Wissen über die MSC-Regulation des angeborenen Immunsystems. Diese Methode kann in zukünftigen Untersuchungen angewendet werden, um die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen vollständig abzugrenzen.

Nach der Berechnung der mittleren ± REM für jede Gruppe zu allen Zeitpunkten werden die Daten im Liniendiagrammformat mit der Y-Achse als relative Fluoreszenzintensität und der X-Achse als Zeit dargestellt. Ergänzende Datei 1 enthält ein Beispiel für Rohdaten aus einem kinetischen Lesen der 96-Well-Platte in einem Tabellenkalkulationsformat.
In dieser Studie zeigen die in Abbildung 3Aund Tabelle 3 dargestellten optimalen Erg...

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Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Diese Kokulturmethode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen rund um die Zellkontaktmechanismen hinter der mesenchymalen Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose zu beantworten und damit die Rolle von MSC bei der Regulierung der angeborenen Immunität zu beleuchten. Diese Technik kann in Hochdurchsatzanalysen angewendet werden. Die an pH-empfindlichen Farbstoffe konjugierten Biopartikel fluoreszieren nur in sauren Phagolysosom-Umgebungen.Daher sind Waschen und Abschrecken notwendig. Diese Methode kann auch auf eine Vielzahl von Kokulturmodellen angewendet werden, die Neutrophile und andere Phagozyten umfassen. Das Verfahren wird Ethan Chetkof, ein Student, der sich derzeit in meinem Labor befindet, demonstrieren.Beobachten Sie zunächst den Zusammenfluss von kultivierten mesenchymalen Stammzellen. Wenn eine Konfluenz von 70-80% erreicht ist, saugen Sie das Wachstumsmedium aus den kultivierten Zellen in einer 100-Millimeter-Schale ab und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Nach dem Absaugen des PBS zwei Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und die Zellen drei Minuten lang inkubieren.Überprüfen Sie nach drei Minuten die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop. Und wenn die Zellen nicht abgelöst sind, inkubieren Sie erneut für ein bis zwei Minuten. Sobald alle Zellen abgelöst sind, fügen Sie fünf Milliliter frisches Wachstumsmedium auf die Platte hinzu.Nachdem Sie die Platte mit der Trypsin-Medium-Mischung gespült haben, verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die Zellen in einem sauberen, sterilen 50 Milliliter konischen Röhrchen zu sammeln. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach dem Absaugen des Überstandes resuspenieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter frischem Wachstumsmedium, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.Für die Zellzählung fügen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 Mikrolitern 0,4% Trypan Blue-Lösung hinzu und fügen dann 10 Mikroliter der Mischung unter dem Deckglas einer Hämozytometer-Zählkammer hinzu. Zählen Sie unter dem inversen oder Hellfeldmikroskop die ungefärbten lebensfähigen Zellen mit einer 10-fachen Objektivlinse und vier Ein-Quadrat-Millimeter-Kammern und berechnen Sie die Zellzahl wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie die Gleichung C1V1 gleich C2V2, um das gewünschte Volumen des frischen Mediums und der Zellsuspension zu bestimmen, die erforderlich sind, um die Zellsuspension in einer Endkonzentration von einmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter herzustellen.Verwenden Sie einen Mehrkanal-Mikropipetter, um 100 Mikroliter der Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte entsprechend dem Plattendesign hinzuzufügen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 530 Mikroliter der Zellsuspension entsprechend dem Plattendesign zu jedem der Kammerobjektträger hinzuzufügen und über Nacht zu inkubieren. Bereiten Sie 10 Milliliter Aktivierungsmedium mit Interferon gamma in einer Konzentration von 250 Nanogramm pro Milliliter vor, um die Makrophagenzellen in einer 100-Millimeter-Schale zu aktivieren.Das Wachstumsmedium aus den Makrophagenzellkulturen absaugen und die Zellen mit fünf Millilitern des Aktivierungsmediums ohne Interferon gamma abspülen. Nach dem Absaugen des Spülmediums in der Versuchsschale werden 10 Milliliter Aktivierungsmedium, ergänzt mit Interferon gamma, zugegeben. Und in der Kontrollschale fügen Sie 10 Milliliter Aktivierungsmedium ohne Interferon gamma hinzu und inkubieren Sie dann die Zellen für 16 bis 24 Stunden.Am Ende der Inkubation wird zur Vorbereitung der Cokulturen das Aktivierungsmedium aus den Makrophagenzellen entfernt und fünf Milliliter frisches Wachstumsmedium zugegeben. Verwenden Sie einen Zellheber, um die Zellen vorsichtig abzukratzen und die Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr zu sammeln. Als nächstes zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue-Ausschluss und Hämozytometrie, gefolgt von der Herstellung von Kontroll- und behandelten Makrophagenzellsuspensionen in der Konzentration von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter, wie zuvor für die mesenchymalen Stammzellen gezeigt.Aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus den experimentellen Vertiefungen, die mesenchymale Stammzellen enthalten. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um 100 Mikroliter der behandelten und kontrollierbaren Makrophagenzellsuspensionen in die entsprechenden experimentellen Vertiefungen entsprechend dem Plattendesign zu geben und über Nacht wie demonstriert zu inkubieren. Saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem vierwandigen Kammerobjektträger mit mesenchymalen Stammzellen ab.Verwenden Sie eine Mikropipette, um 530 Mikroliter der Makrophagenzellsuspension entsprechend dem Design in die entsprechenden Vertiefungen zu geben und über Nacht zu inkubieren. Geben Sie einen Milliliter Lebendzell-Bildgebungsmedium in die Durchstechflasche mit einem Milligramm Zymosan-Partikeln und sammeln Sie die mittlere Partikelmischung in einem Glaskulturröhrchen. Nachdem Sie die Durchstechflasche mit einem zusätzlichen Milliliter Bildgebungslösung gespült haben, übertragen Sie das gespülte Bildgebungsmedium in das Glasröhrchen und fügen Sie dann drei Milliliter zusätzliche Bildgebungslösung hinzu, um 0,2 Milligramm pro Milliliter Zymosan-Partikelsuspension zu erhalten.Wirbeln Sie die Zymosan-Suspension mit schnellen Impulsen für 30 bis 60 Sekunden und verwenden Sie dann einen Sondenschallgerät, um die Suspension mit 60 schnellen Impulsen zu beschallen. Nachdem Sie das Medium abgesaugt haben, spülen Sie die experimentellen Vertiefungen und Reagenz-Blankos mit 100 Mikrolitern Lebendzellbildgebungslösung ab. Als nächstes saugen Sie die Lebendzellbildgebungslösung aus den Vertiefungen ab und fügen Sie 100 Mikroliter der Zymosan-Suspension hinzu.Öffnen Sie das Plattenfach des Fluoreszenzlesers über die Touchpad-Oberfläche. Stellen Sie den Teller ohne Deckel in das Fach mit dem A1-Well in der oberen linken Ecke. Schließen Sie das Fach mit dem Touchpad und klicken Sie auf die grüne Lesetaste im oberen Menü.Um den Phagozytose-Assay durchzuführen, werden nach dem Spülen der ersten experimentellen Vertiefung mit 750 Mikrolitern des bildgebenden Mediums 400 Mikroliter der Zymosan-Suspension hinzugefügt, wobei die verbleibenden Vertiefungen im Wachstumsmedium verbleiben. Als nächstes legen Sie den Objektträger auf die inkubierte Stufe des Bildgebungssystems. Verwenden Sie die Imaging-Software.Wählen Sie auf der Registerkarte Suchen die Option Hellfeld aus, und klicken Sie dann auf das Okularsymbol. Verwenden Sie das 10-fache Objektiv mit dem Okular und dem Fokussierknopf, um auf die Zellen zu fokussieren. Wählen Sie die Registerkarte Erfassung aus.Öffnen Sie das Dropdown-Menü des Experiments und wählen Sie einen Satz von Wellenlängen aus, der einen EGFP-Filterset für 509 Nanometer Anregung und 533 Nanometer Emissionswellenlängen des pH-empfindlichen Farbstoffs enthält. Wenn noch etwa zwei Minuten auf dem Timer verbleiben, klicken Sie auf das 20X-Symbol im Objektivmenü, um das Objektiv in 20X zu ändern, klicken Sie dann auf das Kanalmenü, wählen Sie EGFP-Filter und stellen Sie im Belichtungsmenü die Belichtungszeit auf 400 Millisekunden ein, um den pH-empfindlichen grünen Fluorophor zu erkennen, und klicken Sie dann auf Live. Nachdem Sie den Fokus eingestellt haben, klicken Sie auf Stopp, um das Licht auszuschalten, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der obersten Zeitraffer-Versuchseinstellung.Wählen Sie im Menü "Fokussierstrategie" die Option "Software-Autofokus" und wählen Sie im Dropdown-Menü die Smart- und Core-Einstellungen aus, um die Zeit der Belichtung während der Ausführung des Autofokus zu verkürzen. Legen Sie im Zeitraffermenü die gewünschte Anzahl der Erfassungen auf 30 bis 60, die Intervallzeit auf eine Minute fest und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Experiment starten, um die Erfassung zu starten. Die Wirkung von Interferon gamma auf die Kokultur wurde untersucht.Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Kokultur von Makrophagen mit mesenchymalen Stammzellen die phagozytische Aktivität des Makrophagen verstärkt. Die Interferon-Gamma-Behandlung reduziert die Aktivität des Makrophagen. In Gegenwart von mesenchymalen Stammzellen wurde die phagozytische Aktivität des Makrophagen jedoch teilweise gerettet.Die optimalen Zelldichten sind in diesen Studien entscheidend. Und wenn die Makrophagenzellen mit einer zu niedrigen Dichte plattiert wurden, wurden Änderungen der Fluoreszenzintensität nicht nachgewiesen. Wenn die Makrophagenzellen mit einer hohen Dichte plattiert wurden, war die Fluoreszenzintensität in allen Gruppen schnell erhöht und Unterschiede wurden nicht erkannt.Eines der wichtigsten Dinge bei diesem Verfahren ist es, sicherzustellen, dass die Zelldichten optimiert und zwischen den Experimenten konsistent gehalten werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

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Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

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Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

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Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

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Beurteilung der immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

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Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

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