Name: mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging at JoVE.com

이 작품은 1626093 및 1919583 보조금 수에 따라 NSF 주요 연구 기기 메커니즘에 의해 지원되었다.

참고: 모든 중간 제제 및 세포 배양 기술은 라미나르 흐름을 가진 생물 안전 캐비닛을 사용하여 무균 조건하에서 수행됩니다. 설명된 모든 배양 배양 단계는 37°C, 5% CO2및 95% 습도의 대기를 유지하도록 설계된 인큐베이터를 사용하여 수행됩니다.
1. 세포 배양
<ol><li>성장 매체의 준비<ol>
<li>MSC와 LADMAC의 경우 50mL의 FBS와 5mL의 항생제/항마이코틱 믹스를 500mL의 높은 포도...

<ol>
	<li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Mesenchymal+stem/multipotent+stromal+cells:+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views.">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li><li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+sensors+and+switchers+of+inflammation.">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li><li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4(+)+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease.">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li><li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation.">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).</li><li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells.">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li><li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells.">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (3), 65 (2013).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production.">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li><li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile.">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).</li><li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive/anti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture.">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li><li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages:+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages.">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li><li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions.">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 56 (2015).</li><li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1/M2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages.">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).</li><li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response.">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS.">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li><li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+immune+response.">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).</li><li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages.">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-&#947;+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c/EBP+pathway.">Interferon-&#947; inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li><li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts.">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li><li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis.">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li><li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye,+pHrodo-SE.">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li></ol>

pH 에 민감한 염료에 컨쥬커드된 생체입자를 이용한 식세포증의 분석은 기존의 형광표지입자(12,19,20)에비해 유리하다는 비교적 새로운 도구이다. 기존의 형광 라벨 입자를 사용하면 엔드 포인트 분석만 가능합니다. 검출은 식세포에 의해 채택되지 않은 입자를 세척하거나 담금질 한 후 형광 현미경 검사및 /또는 분광로메로 수...

중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 결합 조직 세포를 초래하는 전구 세포입니다. MSC는 성인 포유류 조직에 존재하며 골수1로부터분리 될 수 있습니다. 그들의 면역 조절 특성 때문에, 이들 세포는 널리 연구된다2. T세포3,4,5,6의 MSC 조절에 초점을 맞춘 초기 연구는 최근에는 선천성 면역의 주요 세포 성분인 대식세포 세포(MΦ)의 조절에 초점을 맞추고 있으며,7, 8,9,10,11,12,13,14의 증가된 관심을 받고 있습니다. . 염증성 질환의 치료에 있는 MSC-MΦ 상호작용의 중요성은 동물 모델8에서단핵구/대식세포의 고갈이 MSC의 치료 효과를 흡수한다는 사실에 의해 강조된다. 여기서, 초점은 MΦ와 MSC의 세포 접촉 상호 작용이다. MSC는 염증에서 항염증 반응으로의 전환을 촉진하여 MΦ의 표현형을 조절할 수 있는 능력을 가지며, 조직 수리 활동8,9,10,11로이어지는 이러한 조절 메커니즘을 입증하기 위해 많은 작업을 수행하였다. 다른 상황에서, MSC는 MΦ 구동 염증반응을지원하거나 악화시킬 수 있으며,13, 13및 MΦ phagocytic 활동을 향상시킬 수있습니다(14,15). 그러나 MSC가 MΦ phagocytic 활동을 조절하는 메커니즘과 조건을 식별하는 기존 데이터가 매우 부족합니다.
MΦ는 협소화(항체 또는 보체 코팅) 또는 비편화병원균(16)을인식하는 수용체의 제품군을 가지고 있다. 후자의 활성화 및 활동은 덜 잘 연구17. 비염증성 체외 환경에서, MSC는 비편성병원체(13)의MΦ phagocytosis를 향상시킵니다. 그러나, MΦ에 의한 비편화 병원균의 인식은 적응성 면역 반응 도중 림프구에 의해 생성된 선동적인 환경에 노출 후에 감소될 수 있다. 자연 킬러 세포및 이펙터 림프구에 의해 방출되는 IFN-γ, 비응진입자(18)의MΦ phagocytosis에 대한 억제 효과가 있다. MΦ phagocytosis의 MSC 직접 접촉 조절의 메커니즘을 연구하기 위해 공동 배양 모델이 개발되었습니다. 여기서 제시된 실험의 목적은 MSC가 MΦ가 IFN-γ(도1)에노출된 후 비편화 병원체의 MΦ phagocytosis를 조절하는지 여부를 결정하는 것이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% trypan blue solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155382PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&#160;Gibco</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiobserver 7 Imaging System</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A8806-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS3008-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&#160;cm2, canted neck, with cap, filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C7231-120EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1 ORL UVA [D1]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12424</td>
			<td>Mouse MSC Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-11.15</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2470</td>
			<td>Mouse M&#934; Cell Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LADMAC Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td>LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Imaging solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P35365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax i3X</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &#181;m</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430167-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stem cell regulation of macrophage phagocytosis; quantitation and imaging

중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전통적으로 그들의 재생 특성에 대 한 공부 되었습니다., 하지만 더 최근에, 그들의 면역 조절 특성 최전선에 있다. 그(것)들은 면역 세포 활동과 상호 작용하고 통제합니다. 이 연구의 초점은 대식세포 활성의 MSC 조절입니다. 대식세포(MΦ) phagocytosis는 감염에 대한 선천적인 면역 계통 반응의 중요한 부분이며, MSC가 이 반응을 조절하는 메커니즘은 적극적인 조사를 받고 있습니다. 여기에 제시된 MΦ phagocytosis의 비편화 된 자모산 입자를 pH 에 민감한 형광 분자에 접합 하는 방법 MSC와 공동 배양 하는 동안. 식세포 활성이 증가하고 표지된 zymosan 입자가 phagolysosome의 산성 환경 내에서 동봉됨에 따라 pH 에 민감한 분자의 형광 강도가 증가합니다. 적절한 발각 및 방출 파장으로, 식세포 활성은 형광 분광계를 사용하여 측정되고 운동 데이터는 70 분 동안 상대 형광 단위의 변화로 제시된다. 이 정량적 데이터를 지원하기 위해, phagocytic 활동의 변화는 동적 이미징을 사용하여 시각화됩니다. 이 방법을 사용한 결과는 공동 배양시 MSC가 순진한 및 IFN-γ 처리MΦ의 비편화 자모산의 MΦ phagocytosis를 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 이 데이터는 선천적인 면역 계통의 MSC 규정의 현재 지식에 추가합니다. 이 방법은 근본적인 세포 및 분자 기계장치를 완전히 묘사하기 위하여 미래 조사에 적용될 수 있습니다.

모든 시간 지점에서 각 그룹에 대한 평균 ± SEM을 계산한 후 데이터는 Y축을 상대형 형광 강도로, X축을 시간으로 선 그래프 형식으로 표시됩니다. 보충 파일 1스프레드시트 형식으로 96웰 플레이트의 운동 판독에서 원시 데이터의 예를 제공합니다.
본 연구에서는, 도 3A에제시된 최적의 결과, 및 표 3에서 제시된 최적 결과는 MSC와?...

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Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.

대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

이 공동 배양 방법은 대식세포 세포 세포의 중간엽 줄기 세포 조절 뒤에 있는 세포 접촉 메커니즘을 둘러싼 주요 질문에 답하는 데 도움이 되며, 따라서 선천성 면역을 조절하는 MSC의 역할을 조명합니다. 이 기술은 높은 처리량 해석에 적용될 수 있습니다. 바이오 입자는 산성 성 균증 환경에서만 pH 에 민감한 염료 형광에 컨쥬게이징됩니다.따라서 세탁 및 담금질이 필요합니다. 이 방법은 또한 호중구 및 그밖 phagocytes를 포함하는 공동 배양 모형의 각종에 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 에단 Chetkof, 내 실험실에서 현재 학부입니다.우선, 배양 된 중간 엽 줄기 세포의 합류를 관찰한다. 70-80%의 합류가 달성되면 배양 된 세포에서 성장 배지를 100 mm 접시에 흡인하고 PBS의 5 밀리리터를 추가하십시오. PBS를 심은 후 0.05%의 트립신 EDTA 용액의 2밀리리터를 추가하고 세포를 3분 동안 배양합니다.3 분 후, 반전 된 현미경을 사용하여 세포 분리를 확인하십시오. 그리고 세포가 분리되지 않으면 다시 1 ~ 2 분 동안 배양하십시오. 모든 세포가 분리되면 접시에 신선한 성장 배지의 5 밀리리터를 추가하십시오.트립신 중간 혼합물을 사용하여 플레이트를 헹구고 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 세포를 깨끗하고 멸균된 50 밀리리터 원추형 튜브로 채취하십시오. 다음으로, 원심분리에 의해 세포를 아래로 펠릿. 상체를 심은 후, 부드럽게 위아래로 파이펫하여 신선한 성장 매체의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다.세포 계산의 경우, 세포 현탁액 10 마이크로리터를 0.4%의 30마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브에 추가한 다음 혈종계 계수 챔버의 커버슬립 아래에 혼합물의 마이크로리터 10개를 첨가한다. 반전 또는 브라이트필드 현미경하에서, 10X 객관적인 렌즈와 4개의 1평방밀리미터 챔버를 사용하여 염색되지 않은 실행 가능한 세포를 계산하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 세포 수를 계산합니다. C1V1 방정식을 사용하여 C2V2와 같으며 밀리리터당 5번째 세포에 10분의 1의 최종 농도에서 세포 현탁액을 준비하는 데 필요한 신선한 배지 및 세포 현탁액의 원하는 부피를 결정한다.다중 채널 마이크로파이프터를 사용하여 플레이트 설계에 따라 96웰 플레이트의 우물에 셀 서스펜션 100 마이크로리터를 추가합니다. 마이크로피펫을 사용하여 플레이트 설계에 따라 각 챔버 슬라이드에 셀 서스펜션 530 마이크로리터를 추가하고 하룻밤 동안 배양합니다. 100mm 접시에서 대식세포를 활성화하기 위해 밀리리터당 250 나노그램의 농도로 인터페론 감마를 함유하는 활성화 배지 10밀리리터를 준비한다.대식세포 배양으로부터 성장 배지를 흡인시키고 인터페론 감마가 없는 활성화 배지의 5밀리리터로 세포를 헹구는다. 실험 접시에 헹기 매체를 흡입 한 후 인터페론 감마로 보충 된 활성화 매체 10 밀리리터를 추가하십시오. 그리고 대조기 접시에 인터페론 감마없이 활성화 배지의 10 밀리리터를 추가 한 다음 세포를 16 ~ 24 시간 동안 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 공동 배양을 준비하기 위한, 대식세포로부터의 활성화 배지를 제거하고 신선한 성장 배지의 5밀리리터를 첨가한다. 셀 리프터를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어 내고 세포를 50 밀리리터 원내 튜브로 수집합니다. 다음으로, Trypan Blue 배제 및 혈혈성 계수를 사용하여 세포를 카운트하고, 관건 줄기 세포에 대해 이전에 입증된 바와 같이 밀리리터 당 2회 10~5번째 세포의 농도에서 대조군 및 처리된 대식세포 현탁액의 제조에 선행한다.중간 엽 줄기 세포를 포함하는 실험 우물에서 배지를 부드럽게 흡인. 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 처리된 100마이크로리터와 대조군 대식세포 현탁액을 플레이트 설계에 따라 적절한 실험용 우물에 추가하고 입증된 대로 하룻밤 동안 배양한다. 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 4 개의 벽 챔버 슬라이드에서 배지를 부드럽게 흡인.마이크로피펫을 사용하여 대식세포 현탁액 530마이크로리터를 설계에 따라 적절한 웰에 추가하고 하룻밤 동안 배양한다. Zymosan 입자의 1 밀리 그램을 포함하는 유리 에 살아있는 세포 이미징 매체의 1 밀리리터를 추가하고 유리 배양 튜브에 중간 입자 혼합물을 수집합니다. 유리질 1밀리리터를 추가로 헹신 후 유리 튜브에 헹은 이미징 배지를 옮은 다음 밀리리터 자이모산 입자 서스펜션당 0.2밀리그램을 달성하기 위해 3밀리리터의 추가 이미징 솔루션을 추가합니다.30~60초 동안 빠른 펄스를 사용하여 Zymosan 서스펜션을 소용돌이친 다음 프로브 초음파 처리기를 사용하여 60개의 빠른 펄스로 서스펜션을 초음파 처리합니다. 매체를 흡입한 후, 살아있는 세포 화상 진찰 용액의 100 마이크로리터로 실험적인 우물과 시약 공백 우물을 헹구는 다. 다음으로, 우물에서 살아있는 세포 이미징 솔루션을 흡인하고 Zymosan 서스펜션의 100 마이크로 리터를 추가합니다.터치 패드 인터페이스를 사용하여 형광 리더의 플레이트 트레이를 엽니다. 왼쪽 상단 모서리에 A1을 잘 놓는 트레이에 뚜껑이 없는 플레이트를 놓습니다. 터치 패드를 사용하여 트레이를 닫고 상단 메뉴의 녹색 읽기 버튼을 클릭합니다.식세포 분석서를 수행하기 위해, 이미징 매체의 750 마이크로리터로 첫 번째 실험을 잘 헹구고, Zymosan 현탁액의 400 마이크로리터를 추가하여 성장 배지에 남아 있는 우물을 남깁니다. 다음으로, 이미징 시스템의 인큐베이션 된 단계에 슬라이드를 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 사용합니다.찾기 탭 에서 브라이트필드 옵션을 선택한 다음 접안 아이콘을 클릭합니다. 10X 목표를 제자리에 두고, 접안렌즈와 초점 손잡이를 사용하여 세포에 집중하십시오. 획득 탭을 선택합니다.실험 드롭다운 메뉴를 열고 509나노미터 의 발산과 533나노미터의 방출 파장을 수용할 수 있도록 설정된 EGFP 필터세트를 선택한다. 타이머에 약 2분이 남은 경우 목표 메뉴의 20X 아이콘을 클릭하여 목표를 20X로 변경한 다음 채널 메뉴를 클릭하고 EGFP 필터를 선택하고 노출 메뉴에서 노출 시간을 400밀리초로 설정하여 pH에 민감한 녹색 불소호를 감지한 다음 라이브로 클릭합니다. 포커스를 조정한 후 정지를 클릭하여 빛을 끄고 정상 시간 경과 실험 설정 옆에 있는 확인란을 선택합니다.포커스 전략 메뉴에서 소프트웨어 자동 초점 및 드롭다운 메뉴에서 자동 초점 옵션을 선택하고 스마트 및 코어 설정을 선택하여 자동 초점이 실행되는 동안 빛에 노출되는 시간을 줄입니다. 시간 경과 메뉴에서 원하는 인수 수를 30~60개로 설정하고 간격 시간을 1분으로 설정한 다음 시작 실험 버튼을 클릭하여 인수를 시작합니다. 인터페론 감마가 공동 배양에 미치는 영향을 연구했습니다.대표적인 결과는 중간엽 줄기 세포를 가진 대식세포의 공동 배양이 대식세포의 식세포 활성을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 인터페론 감마 치료는 대식세포의 활성을 감소시킨다. 그러나, 중간엽 줄기 세포의 존재에서, 대식세포 세포 활성은 부분적으로 구출되었다.최적의 세포 밀도는 이 연구 결과에서 중요합니다. 그리고 대식세포가 밀도가 너무 낮게 도금되었을 때 형광 강도의 변화가 감지되지 않았다. 대식세포가 고밀도로 도금되었을 때, 형광 강도는 모든 군에서 급속히 상승하였고 차이는 분별되지 않았다.이 절차 동안 가장 중요한 것 중 하나는 세포 밀도가 최적화되고 실험 사이에 일관되게 유지되도록하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

연구

면역학 및 감염병학

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

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생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

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대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

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인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...