Name: study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Agradecemos el apoyo técnico del Dr. Tz-Ling Chen. Agradecemos a la Instalación Central Nacional de ARNi (Academia Sinica, Taiwán) por proporcionar lentivirus shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 y MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

El manejo del lentivirus se realiza según la regulación del Departamento de Salud y Seguridad Ambiental de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Taiwán.
1. Preparación de líneas celulares madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPC)
<ol><li>Mantener la línea celular iHSPC en medio RPMI 1640 completo que contenga 100 ng/mL FL y 1 μM β-estradiol.</li>
	<li>Pase las células en una proporción de 1:10 cada 3 días. NOTA: Haga un medio RPMI 1640 complet...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice.">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+monocytes+and+macrophages:+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny.">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li><li>Blasius, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity.">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li><li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential.">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection.">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li><li>Sorgi, F. 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Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions:+Digesting+Information.">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li><li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signaling+in+growth,+metabolism,+and+disease.">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li></ol>

Los vectores de ARNt sh basados en lentivirus se utilizan a menudo para el silenciamiento de genes por transducción viral en las células y permiten una integración estable en el genoma del huésped. Sin embargo, es necesario considerar varias eficiencias de transducción en diferentes tipos de células, y se han adoptado varios enfoques para superar este problema. 
El polibreno es un polímero policatiónico que puede neutralizar las cargas en la membrana celular, mejorando así la unión d...

Los DC son reguladores clave de la inmunidad innata y adaptativa1. Los DC se clasifican principalmente en dos poblaciones funcionalmente distintas, a saber, pDC y CDC. Además, los cDC comprenden dos subconjuntos, a saber, los cDC de tipo I y tipo II o cDC1 y cDC2, respectivamente2. Los pDC, que expresan BST2, Siglec-H y niveles intermedios de CD11c en ratones3,4, son las células que pueden secretar grandes cantidades de IFN-I durante la inflamación y la infección viral5. Debido a su robusta capacidad de producción de IFN-I, también se sospecha que desempeñan un papel clave en la progresión de enfermedades autoinmunes, incluido el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los cDC1s, definidos por la expresión superficial de XCR1, CD8a, CLEC9A y CD103 en ratones7, están especializados en la activación y polarización de células T citotóxicas CD8+ (CTL) a través de la presentación cruzada de antígenos, iniciando así la inmunidad tipo I en respuesta a patógenos intracelulares y cáncer8,9. Por otro lado, los cDC2s, que expresan CD11b y CD172α (también conocidos como Sirpα) tanto en humanos como en ratones, pueden activar las células T CD4+ y promover la respuesta inmune tipo II frente a alérgenos y parásitos10, así como modular la inmunidad tipo III tras el reconocimiento extracelular de bacterias y microbiota11,12.
La diversificación de los DC está determinada por un grupo de TF a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en el BM. E2-2 (codificado por Tcf4) es un regulador maestro para la diferenciación y función de los pDC13,14. Por el contrario, el inhibidor de la unión al ADN 2 (ID2) impulsa la especificación de cDC e inhibe el desarrollo de pDC a través del bloqueo de la actividad de la proteína E15. Además, el desarrollo de cDC1 requiere IRF8 y BATF3, mientras que la diferenciación de cDC2 depende en gran medida de IRF416. Trabajos recientes han explorado la heterogeneidad de los pDCs17 y cDCs y su regulación transcripcional18. Debido a la complejidad de la red de CC, existe una necesidad insatisfecha de establecer una plataforma para identificar otros TF que controlen el desarrollo y la funcionalidad de los CONTROLADORES.
Aquí, utilizamos un iHSPC que se generó al expresar la translocación nuclear regulada por estrógenos de Hoxb8 en células BM (también conocidas como células Hoxb8-FL)19. Los iHSPC pueden proliferar y permanecer en una etapa indiferenciada en presencia de β-estradiol y ligando Flt3 (FL), mientras que comienzan a diferenciarse en diferentes tipos de DC en presencia de FL al retirar β-estradiol19. Sobre la base de esta característica, podemos derribar genes de interés en la etapa progenitora, seguido de examinar el efecto sobre la diferenciación in vitro de pDC y cDC. Por lo tanto, este método es una herramienta poderosa para descubrir los genes que regulan el desarrollo y la función de los DC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117324</td>
			<td>(Clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>(Clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>(Clone: RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro tube</td>
			<td>&#160;ExtraGene</td>
			<td>TUBE-170-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture-treated plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt3 ligand (FL)</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA (Taregt sequence/clone ID)</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shId2&#160; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro

Las células dendríticas (DC) son importantes células presentadoras de antígenos que conectan las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los DC son heterogéneos y se pueden dividir en DC convencionales (cDC) y DC plasmocitoides (pDC). Los cDC se especializan en presentar antígenos y activar células T naïve. Por otro lado, los pDC pueden producir grandes cantidades de interferones tipo I (IFN-I) durante la infección viral. La especificación de los DC ocurre en una etapa temprana de los progenitores de DC en la médula ósea (BM) y se define por una red de factores de transcripción (TF). Por ejemplo, los cDC expresan altamente ID2, mientras que los pDC expresan altamente E2-2. Dado que se están identificando cada vez más subconjuntos de DC, existe un creciente interés en comprender los TF específicos que controlan el desarrollo de DC. Aquí, establecemos un método para detectar TF críticos para la diferenciación de DC in vitro mediante la entrega de lentivirus portadores de ARN de horquilla corta (shRNA) en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPC). Después de la selección y diferenciación in vitro , el potencial cDC y pDC de las líneas celulares de derribo estable se analiza mediante citometría de flujo. Este enfoque proporciona una plataforma para identificar genes que potencialmente gobiernan los destinos de DC de progenitores in vitro.

Se muestra el mapa del vector lentiviral pLKO.1-Puro (Figura 1). Después de la administración de lentivirus que expresa shRNA contra LacZ (un control no dirigido), Tcf4 e Id2 en iHSPC, la eficiencia de derribo confirmada por RT-qPCR reveló que la expresión de Tcf4 se redujo en shTcf4 iHSPCs, en comparación con shLacZ iHSPCs (Figura 2A). Por otro lado, también se observó la disminución de la expresión...

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Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Las células dendríticas, o CD, son células inmunes clave que unen el sistema inmune innato y adaptativo. Si bien los DC son heterogéneos, este método nos ayuda a comprender qué genes, incluidos los factores de transcripción, pueden regular el desarrollo de DC. Esta técnica proporciona una forma simple y rápida de identificar un gen que controla el desarrollo de DC a partir de su progenitor in vitro.Para empezar, mantenga las células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas o iHSPC en medio RPMI 1640 completo, complementado con 100 nanogramos por mililitro del ligando FLT3 y un beta estradiol micromolar. Para la transducción lentiviral, coloque las iHSPC en placas de 12 pocillos a una densidad de una vez 10 a la quinta célula por pocillo y un mililitro de medio completo que contenga el ligando FLT3, beta estradiol y polibreno. Luego, agregue el lentivirus que lleva el ARN de horquilla corta en cada pozo a una multiplicidad de infección de 100.A continuación, gire la placa a 1100 veces g y 37 grados Celsius durante 90 minutos, luego incube las células infectadas durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, retire el polibreno recolectando las células en tubos de 15 mililitros en centrifugación, luego reemplace el medio con un medio completo fresco que contenga el ligando FLT3 y el beta estradiol. Después de 24 horas adicionales, agregue seis microgramos por mililitro de puromicina al medio para seleccionar las células infectadas.Reemplace el medio de selección cada tres días y mantenga las células durante al menos una semana para expandir los iHSPC transducidos de manera estable. Generar y mantener iHSPC de derribo estables para LacZ, Tcf4 e Id2 en medio completo suplementado con el ligando FLT3 y beta estradiol. Para iniciar la diferenciación in vitro, recoja los iHSPC indiferenciados en tubos de 15 mililitros y gule las células por centrifugación.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en un medio completo que contenga solo el ligando FLT3 y luego sembrarlas a una densidad de dos veces 10 a la quinta venta por mililitro en una placa de 12 pocillos. Después de tres días, agregue un mililitro de medio completo fresco que contenga el ligando FLT3.Después de dos días adicionales, proceda a analizar las células diferenciadas por citometría de flujo. Para el análisis citométrico de flujo, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces en la placa y luego recoja las células en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugue los tubos y deseche el sobrenadante antes de volver a depositar las celdas en 50 microlitros de búfer de fax.A continuación, agregue 50 microlitros de anti-CD16 por 32 hibridoma sobrenadante e incube durante cinco a 10 minutos en hielo. Luego, agregue anticuerpos conjugados con colorante fluorescente directamente a las células e incube durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Después de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón de fax y centrifugue la muestra.Después de la centrifugación, resuspend las células en 100 microlitros de tampón de fax y analizar las muestras por citometría de flujo. Después de un corto knockdown mediado por ARN de la horquilla de LacZ, Tcf4 e Id2 en iHSPCS, la confirmación de la eficiencia de knockdown por RTQ-PCR mostró que la expresión de los iHSPC de knockdown de Tcf4 y Tcf4 se redujo en comparación con la de los iHSPC de knockdown de LacZ. Se observaron resultados similares para la expresión de Id2 en los iHSPC de derribo de Id2.Después de cultivar iHSPC de derribo de LacZ durante cinco días, la frecuencia de células CD11c positivas, que representan la población de células dendríticas, fue de alrededor del 95%. Un análisis adicional de las células dendríticas CD11c positivas derivadas de los iHSPC de derribo de LacZ reveló que el 70% eran células dendríticas convencionales, mientras que el 22% eran células dendríticas plasmocitoides. Los iHSPC de derribo Tcf4 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas plasmocitoides que controla el derribo de LacZ.En contraste, los iHSPC de derribo Id2 generaron un porcentaje significativamente menor de células dendríticas convencionales que los controles de derribo de LacZ, pero un mayor porcentaje de células dendríticas plasmocitoides. Las infecciones por espín aumentan la eficiencia de transducción del shRNA portador de lentivirus en los iHSPC. Esta técnica aborda el papel de los factores de transcripción y facilita el estudio de otros genes en la transducción o metabolismo de señalización de citoquinas, que probablemente estén involucrados en el desarrollo de DC.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Investigación

Inmunología e Infección

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

El análisis de la maduración pulmonar de células dendríticas y migración durante la inflamación de las vías alérgica

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP como un nuevo enfoque para prevenir la infección: Preparación y<em&gt; In vitro</em&gt; Propiedades antimicrobianas de PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Diferenciación inducida de células similares a células M en monocapas de enteroide ileal derivadas de células madre humanas

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...