Name: study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Vi är tacksamma för teknisk support från Dr. Tz-Ling Chen. Vi tackar National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) för att ha tillhandahållit shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 och MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Hantering av lentivirus utförs enligt regleringen av Institutionen för miljöhälsa och säkerhet vid National Taiwan University College of Medicine.
1. Beredning av odödliggjord hematopoetisk stam och stamceller (iHSPCs)
<ol><li>Håll iHSPC-cellinjen i komplett RPMI 1640-medium som innehåller 100 ng/mL FL och 1 μM β-estradiol.</li>
	<li>Passage cellerna i ett förhållande av 1:10 var tredje dag. OBS: Gör komplett RPMI 1640 medium genom att komplettera med 10% fetala nötkreatur s...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice.">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+monocytes+and+macrophages:+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny.">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li><li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12.">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li><li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity.">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li><li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+murine+dendritic+cells.">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li><li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8&#945;(+)+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites.">CD8&#945;(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li><li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function.">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+transcription-factor-dependent+CD103(+)CD11b(+)+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation.">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li><li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD301b++dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity.">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li><li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development.">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li><li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification.">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li><li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8&#945;++and+CD103++dendritic+cell+lineages.">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8&#945;+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development.">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li><li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells.">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li><li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity.">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li><li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential.">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection.">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li><li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer.">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li><li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells.">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions:+Digesting+Information.">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li><li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signaling+in+growth,+metabolism,+and+disease.">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li></ol>

Lentivirusbaserade shRNA-vektorer används ofta för gendämpning genom virustransduktion i celler och möjliggör stabil integration i värdgenomet. Olika transduktionseffektivitet i olika celltyper måste dock övervägas, och ett antal metoder har vidtagits för att övervinna detta problem. 
Polybrene är en polyklik polymer som kan neutralisera laddningarna på cellmembranet och därigenom förbättra virionbindningen till cellerna under transduktion20. Även om de...

DCs är viktiga tillsynsmyndigheter för medfödd och adaptiv immunitet1. DCs klassificeras huvudsakligen i två funktionellt distinkta populationer, nämligen PDC och CDC. CDC omfattar dessutom två delmängder, nämligen cDC av typ I och typ II, cDC1 respektive cDC2s. pDC, som uttrycker BST2, Siglec-H och mellanliggande nivåer av CD11c hos möss3,4, är de celler som kan utsöndra stora mängder IFN-I under inflammation och virusinfektion5. På grund av deras robusta IFN-I-producerande förmåga misstänks de också spela en nyckelroll i utvecklingen av autoimmuna sjukdomar, inklusive systemisk lupus erythematosus (SLE)6. cDC1s, som definieras av ytuttrycket av XCR1, CD8a, CLEC9A och CD103 hos möss7, är specialiserade på aktivering och polarisering av cytotoxiska CD8 + T-celler (CTLs) genom antigen korspresentation, vilket initierar typ I immunitet som svar på intracellulära patogener och cancer8,9. Å andra sidan kan cDC2s, som uttrycker CD11b och CD172α (även känd som Sirpα) hos både människor och möss, aktivera CD4 + T-celler och främja typ II immunsvar mot allergen och parasiter10, samt modulera typ III immunitet efter extracellulära bakterier och mikrobiota erkännande11,12.
Diversifiering av DC bestäms av en grupp TFs från hematopoetiska stamceller och stamceller (HSPCs) i BM. E2-2 (kodad av Tcf4) är en master regulator för differentiering och funktion av PDC13,14. Däremot driver hämmaren av DNA-bindning 2 (ID2) cDC-specifikation och hämmar pDC-utveckling genom att blockera E-proteinaktivitet15. Dessutom kräver utvecklingen av cDC1s IRF8 och BATF3, medan differentiering av cDC2s i hög grad beror på IRF416. De senaste verken har undersökt heterogeniteten hos PDC17 och CDC och deras transkriptionsreglering18. På grund av komplexiteten i DC-nätverket finns det ett ouppfyllt behov av att upprätta en plattform för att identifiera andra TFs som styr utvecklingen och funktionaliteten hos DCs.
Här använde vi en iHSPC som genererades genom att uttrycka östrogenreglerad nukleär flyttning av Hoxb8 i BM-celler (även kallad Hoxb8-FL-celler)19. iHSPCs kan sprida sig och förbli i ett odifferentierat stadium i närvaro av β-estradiol och Flt3 ligand (FL), medan de börjar differentiera sig till olika DC-typer i närvaro av FL vid tillbakadragande av β-estradiol19. Baserat på denna funktion kan vi slå ner gener av intresse i stamföreläggandestadiet, följt av att undersöka effekten på in vitro-differentiering av pDC och CDC. Därför är denna metod ett kraftfullt verktyg för att upptäcka de gener som reglerar utvecklingen och funktionen hos DCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117324</td>
			<td>(Clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>(Clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>(Clone: RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro tube</td>
			<td>&#160;ExtraGene</td>
			<td>TUBE-170-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture-treated plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td>Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt3 ligand (FL)</td>
			<td>home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>BIOLINE</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shRNA (Taregt sequence/clone ID)</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shId2&#160; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td>
			<td>The RNAi Consortium (TRC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of dendritic cell development by short hairpin rna-mediated gene knockdown in a hematopoietic stem and progenitor cell line in vitro

Dendritiska celler (DCs) är viktiga antigen-presenterar celler som förbinder medfödda och adaptiva immunsvar. DCs är heterogena och kan delas in i konventionella DCs (cDC) och plasmacytoid DCs (PDC). cDC är specialiserat på att presentera antigener för och aktivera naiva T-celler. Å andra sidan kan PDCs producera stora mängder av typ I interferoner (IFN-I) under virusinfektion. Specifikationen av DCs sker i ett tidigt skede av DC-stamceller i benmärgen (BM) och definieras av ett nätverk av transkriptionsfaktorer (TFs). CDCs uttrycker till exempel mycket ID2, medan PDC:er uttrycker E2-2. Eftersom fler och fler delmängder av DC identifieras finns det ett växande intresse för att förstå specifika TFs som styr utvecklingen av domänkontrollanten. Här etablerar vi en metod för att screena TFs kritiska för DCs differentiering in vitro genom att leverera lentivirus som bär kort hårnål RNA (shRNA) till en odödliggjord hematopoetisk stam och stamceller (iHSPCs) linje. Efter urval och in vitro differentiering analyseras cDC och pDC potential av de stabila knockdown cellinjerna av flöde cytometri. Detta tillvägagångssätt ger en plattform för att identifiera gener som potentiellt styr DC-öden från förfäder in vitro.

Kartan över lentiviral vektor pLKO.1-Puro visas (bild 1). Efter leverans av lentivirus uttrycker shRNA mot LacZ (en icke-inriktning kontroll), Tcf4 och Id2 i IHSPCs, knockdown effektivitet bekräftas av RT-qPCR visade att uttrycket av Tcf4 minskades i shTcf4 iHSPCs, jämfört med shLacZ iHSPCs (figur 2A). Å andra sidan observerades det minskade uttrycket av Id2 också i shId2 iHSPCs, jämf...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro at JoVE.com

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Här tillhandahåller vi ett protokoll för screening potentiella transkription faktorer inblandade i utvecklingen av dendritiska cell (DC) med hjälp av lentiviral transduktion av shRNA för att erhålla stabil knockdown cellinjer för in vitro DC differentiering.

Studie av dendritisk cellutveckling av kort hårnål RNA-medierad gen knockdown i en hematopoetisk stam och progenitor cellinje in vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Dendritiska celler, eller DCs, är viktiga immunceller som förbinder det medfödda och adaptiva immunsystemet. Medan DCs är heterogena, hjälper denna metod oss att förstå vilka gener, inklusive transkriptionsfaktorer, som kan reglera DC-utveckling. Denna teknik ger ett enkelt och snabbt sätt att identifiera en gen som styr DC-utveckling från deras föregångare in vitro.Till att börja med, upprätthålla den odödliga hematopoetiska stammen och stamcellerna eller iHSPCs i komplett RPMI 1640 medium, kompletterat med 100 nanogram per milliliter av FLT3 ligand och en mikromolar beta estradiol. För lentiviral transduktion, plätera iHSPCs i 12 brunnsplattor med en densitet av en gånger 10 till de femte cellerna per brunn och en milliliter komplett medium som innehåller FLT3 ligand, beta estradiol och polybrene. Tillsätt sedan lentiviruset som bär det korta hårnåls-RNA i varje brunn vid en multiplicitet av infektion på 100.Snurra sedan plattan vid 1100 gånger g och 37 grader Celsius i 90 minuter och inkubera sedan de infekterade cellerna över natten vid 37 grader Celsius. Följande dag, ta bort polybrene genom att samla cellerna i 15 milliliter rör i centrifugering, efter att ha ersatt mediet med färskt komplett medium som innehåller FLT3 ligand och beta estradiol. Efter ytterligare 24 timmar, tillsätt sex mikrogram per milliliter puromycin till mediet för att markera de infekterade cellerna.Byt ut markeringsmediet var tredje dag och behåll cellerna i minst en vecka för att expandera de stabilt transduced iHSPCs. Generera och upprätthålla stabil knockdown iHSPCs för LacZ, Tcf4 och Id2 i komplett medium kompletterat med FLT3 ligand och beta estradiol. För att initiera in vitro-differentiering samla de odifferentierade iHSPCs i 15 milliliter rör och pellet cellerna genom centrifugering.Efter centrifugering kassera supernatanten och tvätta cellerna två gånger med 10 milliliter PBS. Efter den andra tvätten återanvänder du cellerna i fullständigt medium som endast innehåller FLT3 ligand och sådr dem med en densitet av två gånger 10 till den femte säljer per milliliter till en 12 brunnsplatta. Efter tre dagar tillsätt en milliliter färskt komplett medium som innehåller FLT3 ligand.Efter ytterligare två dagar, fortsätt att analysera de differentierade cellerna efter flöde cytometri. För flödescytometrisk analys, pipettera cellerna upp och ner två till tre gånger i plattan och samla sedan cellerna i 1,5 milliliterrör. Centrifugera rören och kassera supernatanten innan cellerna återanvänds i 50 mikroliter faxbuffert.Tillsätt sedan 50 mikroliter anti-CD16 med 32 hybridom supernatant och inkubera i fem till 10 minuter på is. Tillsätt sedan fluorescerande färgkonjugerade antikroppar direkt till cellerna och inkubera i 15 minuter på is i mörkret. Tvätta cellerna med en milliliter faxbuffert efter inkubation och centrifugera provet.Efter centrifugering återanvänder du cellerna i 100 mikroliter faxbuffert och analyserar proverna efter flödescytometri. Efter kort hårnål RNA-medierad knockdown av LacZ, Tcf4 och Id2 i iHSPCS, bekräftelse av knockdown effektivitet av RTQ-PCR visade att uttrycket av Tcf4 och Tcf4 knockdown iHSPCs minskade jämfört med det i LacZ knockdown iHSPCs. Liknande resultat observerades för Id2 uttryck i Id2 knockdown iHSPCs.Efter odling LacZ knockdown iHSPCs i fem dagar, frekvensen av CD11c positiva celler, som representerar dendritiska cellpopulationen, var cirka 95%Men slå ner Tcf4 eller Id2 minskade något genereringen av CD11c-positiva dendritiska celler. Ytterligare analys av CD11c-positiva dendritiska celler som härrör från LacZ knockdown iHSPCs visade att 70%var konventionella dendritiska celler medan 22%var plasmacytoid dendritiska celler. Tcf4 knockdown iHSPCs genererade en betydligt lägre andel plasmacytoid dendritiska celler som LacZ knockdown kontrollerar.Däremot genererade Id2 knockdown iHSPCs en betydligt lägre andel konventionella dendritiska celler än LacZ knockdown kontroller men en högre andel plasmacytoid dendritiska celler. Spinninfektioner ökar flyttningseffektiviteten hos lentivirusbärande shRNA i iHSPCs. Denna teknik behandlar transkriptionsfaktorers roll och underlättar studier av andra gener i cytokinsignaleringstransduktion eller metabolism, som sannolikt kommer att vara involverade i DC-utveckling.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generering av Multivirus-specifika T-celler för att förhindra / behandla virusinfektioner efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analys av Pulmonell mognad av dendritiska celler och migration under Allergisk luftvägsinflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP som en ny metod för att förhindra infektion: Förberedelser och<em&gt; In vitro</em&gt; Antimikrobiella egenskaper hos PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

En Tetracyklin-reglerade cellinje ger hög-titer lentivirusvektorer som specifikt riktar dendritiska celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifiera DNA Mutationer i renat Hematopoietic Stem / progenitorceller

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Bedöma utvecklingen av murina plasmacytoid dendritiska celler i Peyers Patches Använda adoptiv överföring av hematopoetiska stamfäder

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utveckling och identifieringen av en ny underpopulation av humant neutrofilt härrörande Giant fagocyter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ett sug Blister protokoll att studera mänsklig T-cell Recall Svaren In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Samtidiga studie av rekrytering av monocyt Subpopulations Under flöde In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Inducerad differentiering av M-Cellliknande celler i humana stamcells-härledda ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...