Denne protokol giver mulighed for realtidsvurdering af forskellige processer og biokemiske parametre inden for lumen af individuelle makropinoomer. Disse metoder kan anvendes til lægemiddelopdagelse i cellebiologien af makropinocytose. Denne protokol giver fordelen ved at afsløre heterogenitet på både cellulært og organelle niveau.
En dag før analysen frø Raw264.7 celler på en tæthed på fem gange 10 til kraften i cellerne i 100 mikroliter per brønd, i et glas bund 96-brønd plade med sorte sider. På dagen for analysen kontrollere, om brøndene er mindst 70% sammenløb. Vask derefter alle brønde med 100 mikroliter HBSS, forvarmet ved 37 grader Celsius.
Derefter tilsættes 100 mikroliter HBSS, der indeholder 0,025 milligram pr. milliliter TMR mærket 70 kilodalton dextran og 0,025 milligram pr. milliliter fluorescein mærket 70 kilodalton dextran i hver brønd, og inkuberer derefter cellerne ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Når inkubationen er færdig, skal du fjerne pladen fra inkubatoren og vaske cellerne seks gange med 100 mikroliter HBSS. Efter den sidste vask tilsættes 100 mikroliter af forvarmet HBSS til cellerne derefter placere pladen på et mikroskop med en opvarmet fase og kammer.
Efter justering af excitation og emissionsparametre for TMR og fluorescein efter behov, erhverve et billede fra hver brønd skiftevis mellem de to fluorophores i mellem hver brønd. Efter den første erhvervelse skal du kontrollere, om alle brøndene forblev i fokus på tværs af hele pladen og derefter erhverve billeder af hver brønd med et til 15 minutters mellemrum i den ønskede tid. Under billedopsamlingen justeres pH-værdi for en 50 milliliter aliquot af en kaliumrig opløsning, der bufferes med 25 millimolar HEPES til 7,5 ved hjælp af 10 molarhydrchlorsyre eller 10 molar kaliumhydroxid efter behov.
Juster derefter pH på 350 milliliter aliquots af kaliumrig opløsning buffered med 25 millimolar MES til pH 6,5, pH 5,5 og pH 5.0. Når billedopsamlingen er færdig, skal du fjerne HBSS fra den 96-brønds plade, der indeholder cellerne, og tilsæt kaliumrig opløsning ved pH 7.5. Derefter tilsættes Nigericin ved en endelig koncentration på 10 mikrogram pr. Milliliter.
Placer pladen tilbage på mikroskopet og erhverve billeder af hver brønd ved hjælp af de samme erhvervelse indstillinger som vist tidligere. For at måle oxidative hændelser inden for makropinoomer, frø RAW264.7 celler i en 96-brønd plade en dag før analysen som påvist tidligere. Så på dagen for analysen vaske alle brønde med 100 mikroliter af HBSS prewarmed til 37 grader Celsius.
Derefter tilsættes 100 mikroliter af HBSS, der indeholder 0,025 milligram pr. milliliter TMR mærket 70 kilodalton dextran og 0,025 milligram pr. milliliter H2DCFDA mærket 70 kilodalton dextran til hver brønd, og inkuberer derefter cellerne ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Efter fjernelse af pladen fra inkubatoren vaskes cellerne seks gange med 100 mikroliter HBSS. Efter den sidste vask tilsættes 100 mikroliter HBSS til hver brønd og placerer pladen på mikroskopet.
Efter justering af excitation og emissionsparametre for TMR og H2DCFDA efter behov, erhverve billeder af hver brønd på et til 15 minutters intervaller som vist tidligere. For at måle protein fordøjelsen i makropinoomer, frø RAW264.7 celler en dag før analysen, som påvist tidligere. Så på dagen for analysen vaske alle brønde med 100 mikroliter af HBSS prewarmed ved 37 grader Celsius.
Næste tilføje 100 mikroliter af HBSS indeholder 0,025 milligram per milliliter af TMR mærket 70 kilodalton dextran i 0,2 milligram per milliliter BODIPY mærket ovalbumin til hver brønd. Inkuber derefter pladen ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Efter fjernelse af cellerne fra inkubatoren skal du vaske dem seks gange med 100 mikroliter HBSS.
Efter den sidste vask tilsættes 100 mikroliter AF HBSS til hver brønd, og placer derefter pladen på mikroskopet. Efter justering af excitation og emissionsparametre for TMR og BODIPY efter behov, erhverve billeder af hver brønd på en til 15 minutters intervaller som vist tidligere. Ved måling af pH, oxidative hændelser eller proteinforringelse i makropinoomer kan forsuringens dynamik ikke måles i en bestemt periode svarende til dextranbelastningsfasen, som varierer afhængigt af den anvendte celletype.
Ved måling af makropinosome pH, fluorescein til TMR forholdet vil blive gradvist mindre og vil plateau inden for 15 minutter efter erhvervelse. Dette plateau svarer til en pH-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1- Ved afslutningen af hver erhvervelse udføres en In situ kalibrering.
Fluorescein til TMR-forholdet bør være størst inden for kalibreringsbufferen ved pH 7.5 og blive gradvist mindre, efterhånden som kalibreringsbufferne bliver mere sure. Dette giver mulighed for generering af en kalibreringskurve. Ved måling af oxidative hændelser inden for makropinoomer vil forholdet mellem H2DCFDA og TMR blive gradvist større og vil sandsynligvis plateau inden for de første 20 til 30 minutter i en aktiveret RAW264.7 celler.
Ved måling af makropinosomal protein fordøjelse, en gradvis stærk fluorescein signal vil blive befriet som ovalbumin fordøjes. I RAW264.7 celler, vil stigningen i fluorescens befriet fra fordøjet BODIPY mærket ovalbumin plateau inden for de første 30 minutter. Med denne nye rolle i homøostase, og det er nyopdaget relevans for kræft patologi, en renæssance makropinocytosis forskning er i øjeblikket i gang.
Disse metoder leveres til en værktøjskasse til at udforske makropinocytoses bidrag til disse studieområder.