Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Wir danken der University of Calgary für ihre Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Dr. Robin Yates für den Zugang zu Reagenzien, Geräten und nützlichen Diskussionen bedanken.

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Züchten Sie Raw264,7-Zellen bei 37 °C und 5% CO2 bis 70% Konfluenz in RPMI, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem Serum.</li>
	<li>Einen Tag vor dem Assay werden Raw264,7-Zellen mit einer Dichte von 5 x 104 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte ausgesät. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung 100 μL Wachstumsmedium enthält. Stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte schwarze Seiten und einen Glasboden für die Bildgebung hat. HINWEIS: Hier wurden...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

Obwohl es eine Reihe von Protokollen für Messungen mit niedrigem und hohem Durchsatz der makropinozytären Aufnahme in Makrophagen, Fibroblasten und sogar Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, es wurden nur sehr wenige Versuche unternommen, die luminale Biochemie dieser dynamischen Kompartimente zu messen. Dies ist wahrscheinlich auf einen Mangel an Sonde...

Makropinozytose bezieht sich auf die Aufnahme großer Mengen extrazellulärer Flüssigkeit in membrangebundene zytoplasmatische Organellen, die Makropinosomen1,2genannt werden. Es ist ein hochkonserviertes Verfahren, das von freilebenden einzelligen Organismen wie der Amöbe Dictyostelium sppdurchgeführt wird. 3, sowie Anthozoen4 und Metazoen2. In den meisten Zellen ist die Makropinozytose ein induziertes Ereignis. Die Ligatur von Zelloberflächenrezeptoren induziert das Hervorkommen von Aktin-getriebenen Plasmamembranverlängerungen, die als Rüschen bezeichnet werden. Ein Bruchteil dieser Rüschen versiegelt sich durch einen schlecht verstandenen Mechanismus an ihren distalen Spitzen, um Makropinosomen zu bilden (obwohl sie den Rahmen dieses Methodenpapiers sprengen, verweisen wir auf detaillierte Übersichten über die Mechanik der Makropinozytose, siehe Referenzen1,2,5,6,7). Der extrazelluläre Reiz, der die Makropinozytose induziert, ist meistens ein löslicher Wachstumsfaktor5,8. Dementsprechend ermöglicht das makropinozytäre Ereignis die Einnahme eines Bolus aus extrazellulärem Material, aus dem die Zelle nützliche Metaboliten ableiten kann, um das Wachstum zu erleichtern. Leider kann dieser Weg zur Nährstoffzufuhr auch die Pathologie vorantreiben. Bestimmte Krebszellen beherbergen Mutationen, die zu einer kontinuierlichen oder konstitutiven Makropinozytose führen. Die kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen erleichtert die unkontrollierte Vermehrung von Krebszellen und wurde mit besonders aggressiven Tumoren in Verbindung gebracht9,10,11,12,13. In ähnlicher Weise können Viren Makropinozytose induzieren, um Zugang zu Wirtszellen zu erhalten, wodurch die Viruspathologie vorangetrieben wird14.
Makropinozytose funktioniert auch bei der Aufrechterhaltung der Immunität gegen Krankheitserreger. Bestimmte angeborene Immunzellen wie Makrophagen und dendritische Zellen beteiligen sich an der konstitutiven und aggressiven Probenahme extrazellulärer Flüssigkeit über Makropinozytose6,15,16. Dieser Modus der Makropinozytose ist unglaublich aktiv, und eine einzelne dendritische Zelle kann sich jede Stunde mit einem Volumen extrazellulärer Flüssigkeit einfüllen, das ihrem eigengewicht entspricht17. Trotz dieser konstitutiven Probenahme replizieren sich Makrophagen und dendritische Zellen nicht unkontrolliert wie Tumorzellen, sondern scheinen das extrazelluläre Material so zu verarbeiten, dass Informationen extrahiert werden können, um über das Vorhandensein oder Sogar Fehlen potenzieller Bedrohungen zu informieren. Informationen werden extrahiert als i) pathogen-assoziierte molekulare Muster, die von intrazellulären Pathogenerkennungsrezeptoren gelesen werden können, und ii) kurze Abschnitte von Aminosäuren, die auf wichtige Histokompatibilitätsmoleküle geladen werden können, um von Zellen des adaptiven Immunsystems gescreent zu werden16,18,19. Ob Krankheitserreger diesen Weg zur Informationsverarbeitung durch Immunzellen untergraben, ist derzeit unklar.
Trotz dieser gut definierten und kritischen Rollen für die Makropinozytose sowohl bei der Aufrechterhaltung der Immunität als auch bei der Homöostase und im Gegensatz zu anderen häufiger untersuchten Modi der Endozytose ist wenig über die innere (luminale) Funktionsweise von Makropinosomen bekannt. Die Entwicklung standardisierter Protokolle und Werkzeuge zur Untersuchung der luminalen Biochemie von Makropinosomen wird uns nicht nur helfen, ihre einzigartige Biologie besser zu verstehen, sondern auch Erkenntnisse liefern, die für neuartige therapeutische Strategien, einschließlich der Medikamentenabgabe, genutzt werden können20. Dieses Methodenmanuskript wird sich auf kürzlich entwickelte Werkzeuge konzentrieren, um auf der Ebene der Einzelnen Organellen verschiedene Aspekte der luminalen Biochemie von Makropinosomen zu sezieren.
Fluorophore können zur Messung spezifischer Biochemien von Organellen verwendet werden, wenn sie sich i) bevorzugt in das interessierende Kompartiment aufteilen und/oder ii) als Reaktion auf den interessierenden Parameter spektrale Veränderungen erfahren. Zum Beispiel sammeln sich im Falle des pH-Werts fluoreszierende schwache Basen wie Acridinorange, Cresylviolett und die LysoTracker-Farbstoffe bevorzugt in sauren Organellen an. Daher ist ihre relative Intensität ein grober Hinweis darauf, dass die markierte Organelle sauer ist. Andere pH-responsive Fluorophore wie Fluorescein, pHrodo und cypHer5e unterliegen spektralen Veränderungen bei der Bindung an Protonen (Abbildung 1A-C). Veränderungen der Fluoreszenzemission von pH-sensitiven Fluorophoren können daher eine sinnvolle Annäherung an den pH-Wert liefern. Die Verwendung von einzelnen Fluorophoren birgt jedoch eine Reihe von Nachteilen. Zum Beispiel können Änderungen der Fokusebene, Photobleaching und Änderungen des Volumens einzelner Organellen, ein häufiges Vorkommen in Makropinosomen21,Änderungen der Fluoreszenzintensität einzelner Fluorophore induzieren, und dies kann nicht leicht für22korrigiert werden. Einzelwellenlängenbewertungen sind zwar nützlich für die Visualisierung saurer Kompartimente, aber daher rein qualitativ.
Ein quantitativerer Ansatz besteht darin, das parameterempfindliche Fluorophor zusammen mit einem Referenzfluorophor auf die interessierende Organelle auszurichten. Das Referenzfluorophor ist idealerweise unempfindlich gegenüber biochemischen Veränderungen innerhalb der Organelle (Abbildung 1D-F) und kann daher verwendet werden, um Veränderungen der Fokusebene, des Organellarvolumens und bis zu einem gewissen Grad des Photobleachings zu korrigieren23. Mit diesem Ansatz, der als duale fluorophore ratiometrische Fluoreszenz bezeichnet wird, kann eine Korrektur erreicht werden, indem ein Verhältnis der Fluoreszenzemission des parametersensitiven Fluorophors zum Referenzfluorophor erzeugt wird.
Hier wird das Protokoll das Prinzip der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Bildgebung nutzen, um pH-Wert, oxidative Ereignisse und Proteinabbau in Makropinosomen zu messen. In jedem Fall wird ein Fluorophor ausgewählt, das empfindlich auf den interessierenden Parameter reagiert, und ein Referenzfluorophor. Um die Fluorophore gezielt auf Makropinosomen auszurichten, werden sie kovalent an 70 kDa Dextran gekoppelt, das bevorzugt in Makropinosomen eingebaut wird24. Alle Assays werden in Raw264.7-Zellen durchgeführt, können aber an andere Zelltypen angepasst werden. Wenn möglich, werden die Fluoreszenzverhältnisse gegen eine Referenzkurve kalibriert, um absolute Werte zu erhalten. Wichtig ist, dass alle Messungen in lebenden Zellen zur dynamischen und quantitativen Beurteilung der luminalen Umgebung von Makropinosomen durchgeführt werden.
Bei der Auswahl pH-sensitiver Fluorophore müssen eine Reihe von Überlegungen abgewogen werden. Der erste ist der pKa des Fluorophors, der den Bereich der pH-Werte angibt, bei dem die Sonde am empfindlichsten ist. Wenn davon ausgegangen wird, dass kurz nach der Bildung der pH-Wert des Makropinosoms nahe an dem des extrazellulären Mediums (~pH 7,2) liegt und dass es durch Wechselwirkungen mit späten Endosomen und Lysosomen (~pH 5,0) progressiv ansäuert, sollte eine Sonde mit einem pKa gewählt werden, die innerhalb dieses Bereichs empfindlich ist(Abbildung 2C). Das Fluorophor Fluorescein, das einen pKa von 6,4 aufstellt, ist in diesem Bereich optimal empfindlich. Es wurde ausgiebig verwendet, um andere ähnliche Organellen, wie Phagosomen, zu messen, und wird das Fluorophor der Wahl in diesem Manuskript22,25sein. Als Referenzfluorophor wird Tetramethylrhodamin verwendet, das unempfindlich gegen pH-Wert ist (Abbildung 1E). Andere Fluorophore wie pHrodo und cypHer5e können Fluorescein ersetzen, wenn die spektralen Eigenschaften von Fluorescein mit anderen experimentellen Variablen übereinstimmen. Einige vorgeschlagene Referenzfluorophore für pHrodo und cypHer5e sind in Abbildung 1 dargestellt.
Eine zweite Überlegung ist die Methode, mit der die beiden Fluorophore spezifisch auf Makropinosomen ausgerichtet werden. Dextran der Größe 70 kDa, das einen hydrodynamischen Radius von etwa 7 nm aufweist, haftet nicht unspezifisch an Zellen und wird in Makropinosomen, aber nicht in Clathrin-beschichtete Gruben oder Caveolae eingebaut und markiert daher Makropinosomen (Abbildung 2A und Abbildung 3A, B)16,24,26. In diesem Protokoll werden Fluorescein-markierte 70 kDa-Dextran und Tetramethylrhodamin (TMR)-markierte 70 kDa-Dextran als pH-sensitive bzw. Referenzsonden verwendet.
In angeborenen Immunzellen stellen Makropinozytose und Phagozytose die beiden Hauptwege für die Internalisierung von exogenem Material zur Verarbeitung und anschließenden Präsentation der adaptiven Immunantwort an Zellen dar27. Die sorgfältige und koordinierte Kontrolle der Redoxchemie des Lumens von Phagosomen und Makropinosomen ist entscheidend für die kontextspezifische Verarbeitung von exogenem Material. Der vielleicht am besten untersuchte Regulator oxidativer Ereignisse in Phagosomen ist die NADPH-Oxidase, ein großer Multi-Subunit-Komplex, der große Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im Lumen von Phagosomen produziert28. In der Tat ist seine Aktivität von zentraler Bedeutung für eine angemessene Antigenverarbeitung innerhalb von Phagosomen29,30. Die Aktivität der NADPH-Oxidase auf makropinosomalen Membranen wurde jedoch nicht untersucht.
In diesem Protokoll wird der H2DCFDA-Succinimidylester zur Messung oxidativer Ereignisse innerhalb des Makropinosoms verwendet. Dies ist eine modifizierte Form von Fluorescein (2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat), das in seiner reduzierten Form minimal fluoreszierend ist. Bei der Oxidation nimmt seine Fluoreszenzemission deutlich zu. Es ist jedoch erwähnenswert, dass H2DCFDA einen signifikanten Vorbehalt hat - da es auf dem Fluorophor Fluorescein basiert, wird seine Fluoreszenz auch in sauren Kompartimenten abgeschreckt, und bei der Gestaltung von Experimenten muss darauf geachtet werden, diese Variable zu kontrollieren28. Ähnlich wie bei der Messung des pH-Werts wird der H2DCFDA-Succinimidylester kovalent an 70 kDa Dextran gebunden und TMR-markiertes 70 kDa Dextran wird als Referenzfluorophor verwendet (Abbildung 3A).
Fluoreszierendes Ovalbumin wird verwendet, um den Proteinabbau in Makropinosomen zu messen. Das hier verwendete Ovalbumin ist dicht mit einem 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL-Farbstoff markiert, der selbst abgeschreckt wird. Bei der Verdauung werden stark fluoreszierende farbstoffmarkierte Peptide freigesetzt. Da Ovalbumin nicht einfach zu 70 kDa Dextran konjugiert werden kann, werden Zellen mit TMR-markiertem 70 kDa Dextran und Fluidphasen-Ovalbumin koinkubiert. Das TMR-Signal wird verwendet, um während der Analyse nach der Bildgebung eine Makropinosom-Maske zu erzeugen, und das vom verdauten Ovalbumin freigesetzte Signal wird innerhalb der Maske gemessen (Abbildung 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

In den letzten Jahren ist das Gebiet der Makropinozytose rasant gewachsen. Makropinozytose hat sich als zentraler Mechanismus herausgestellt, durch den angeborene Immunzellen die organismische Homöostase und Immunität aufrechterhalten. Gleichzeitig und im Gegensatz zu seiner homöostatischen Rolle kann es auch verschiedene Pathologien, einschließlich Krebs und Virusinfektionen, antreiben. Im Gegensatz zu anderen Modi der Endozytose bleiben die Werkzeuge, die zur Untersuchung der Reifung von Makropinosomen entwickelt wurden, unterentwickelt. Hier beschreibt das Protokoll neu entwickelte Werkzeuge zur Untersuchung der Redoxumgebung im Lumen früher und reifender Makropinosomen. Methoden zur Verwendung der ratiometrischen Fluoreszenzmikroskopie zur Beurteilung des pH-Werts, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und der abbauenden Kapazität innerhalb des Lumens einzelner Makropinosomen in lebenden Zellen werden beschrieben. Einzelorganellenmessungen bieten den Vorteil, dass sie räumlich-zeitliche Heterogenität aufdecken, die bei populationsbasierten Ansätzen oft verloren geht. Der Schwerpunkt liegt auf den Grundprinzipien der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie, einschließlich Sondenauswahl, Instrumentierung, Kalibrierung und Einzelzell- und Populations-basierten Methoden.

Bei der Messung des pH-Werts von Makropinosomen gibt es einen Zeitraum, für den die Dynamik der Versauerung nicht gemessen werden kann. Dieser Zeitraum entspricht der Dextran-Ladephase (graues Feld in Abbildung 2C und Abbildung 3C,D)und variiert je nach verwendetem Zelltyp. Die Länge der Ladephase variiert mit (i) der makropinozyten Aktivität der Zellen und (ii) der Empfindlichkeit des verwendeten Instruments. Es wird empfohlen, diesen Zeitra...

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Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Wir beschreiben Protokolle zur Messung von pH-Wert, oxidativen Ereignissen und Proteinverdauung in einzelnen Makropinosomen in lebenden Zellen. Ein Schwerpunkt liegt auf der dualen fluorophoren ratiometrischen Mikroskopie und den Vorteilen, die sie gegenüber populationsbasierten Techniken bietet.

Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeitbewertung verschiedener Prozesse und biochemischer Parameter innerhalb des Lumens einzelner Makropinosomen. Diese Methoden können zur Wirkstoffforschung in der Zellbiologie der Makropinozytose eingesetzt werden. Dieses Protokoll bietet den Vorteil, Heterogenität sowohl auf zellulärer als auch auf Organellenebene aufzudecken.Einen Tag vor dem Assay samen Raw264,7 Zellen mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch der Kraft der Zellen in 100 Mikrolitern pro Vertiefung, in einer Glasboden-96-Well-Platte mit schwarzen Seiten. Überprüfen Sie am Tag des Assays, ob die Bohrungen zu mindestens 70% konfluent sind. Dann waschen Sie alle Brunnen mit 100 Mikrolitern HBSS, vorgewarmt bei 37 Grad Celsius.Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter HBSS hinzu, die 0,025 Milligramm pro Milliliter TMR mit 70 Kilodalton Dextran und 0,025 Milligramm pro Milliliter Fluoreszein mit 70 Kilodalton Dextran in jeder Vertiefung enthalten, und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen Sie die Zellen sechsmal mit 100 Mikrolitern HBSS. Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter vorgewarmtes HBSS in die Zellen geben und die Platte dann auf ein Mikroskop mit einem beheizten Tisch und einer Kammer legen.Nachdem Sie die Anregungs- und Emissionsparameter für TMR und Fluorescein nach Bedarf angepasst haben, erhalten Sie ein Bild von jeder Vertiefung, die zwischen den beiden Fluorophoren zwischen jeder Vertiefung wechselt. Überprüfen Sie nach der ersten Aufnahme, ob alle Bohrungen über die gesamte Platte im Fokus geblieben sind, und erfassen Sie dann Bilder von jeder Bohrung in Abständen von einem bis 15 Minuten für die gewünschte Zeitspange. Passen Sie während der Bildaufnahme den pH-Wert eines 50-Milliliter-Aliquots einer kaliumreichen Lösung, die mit 25 Millimolar-HEPES gepuffert ist, je nach Bedarf mit 10 molarer Salzsäure oder 10 molaren Kaliumhydroxiden auf 7,5 an.Stellen Sie dann den pH-Wert von 350 Milliliter Aliquoten der kaliumreichen Lösung, die mit 25 Millimolar MES gepuffert ist, auf pH 6,5, pH 5,5 und pH 5,0 ein. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, entfernen Sie das HBSS von der 96-Well-Platte, die die Zellen enthält, und fügen Sie die kaliumreiche Lösung bei pH 7,5 hinzu. Dann fügen Sie Nigericin in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.Legen Sie die Platte wieder auf das Mikroskop und erfassen Sie Bilder von jeder Vertiefung mit den gleichen Aufnahmeeinstellungen wie zuvor gezeigt. Um oxidative Ereignisse in Makropinosomen zu messen, säen Sie RAW264,7-Zellen einen Tag vor dem Assay in einer 96-Well-Platte aus, wie zuvor gezeigt. Dann am Tag des Assays alle Brunnen mit 100 Mikrolitern HBSS vorgewarmt auf 37 Grad Celsius waschen.Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter HBSS mit 0,025 Milligramm pro Milliliter TMR mit 70 Kilodalton Dextran und 0,025 Milligramm pro Milliliter H2DCFDA mit 70 Kilodalton Dextran zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach dem Entfernen der Platte aus dem Inkubator waschen Sie die Zellen sechsmal mit 100 Mikrolitern HBSS. Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter HBSS in jede Vertiefung geben und die Platte auf das Mikroskop legen.Nachdem Sie die Anregungs- und Emissionsparameter für TMR und H2DCFDA nach Bedarf angepasst haben, erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von einem bis 15 Minuten, wie zuvor gezeigt. Um die Proteinverdauung in Makropinosomen zu messen, säen Sie RAW264,7-Zellen einen Tag vor dem Assay, wie zuvor gezeigt. Am Tag des Assays waschen Sie dann alle Brunnen mit 100 Mikrolitern HBSS, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt sind.Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter HBSS mit 0,025 Milligramm pro Milliliter TMR-markiertem 70 Kilodalton Dextran in 0,2 Milligramm pro Milliliter BODIPY markiertem Ovalbumin zu jeder Vertiefung hinzu. Anschließend die Platte bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Nachdem Sie die Zellen aus dem Inkubator entfernt haben, waschen Sie sie sechsmal mit 100 Mikrolitern HBSS.Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter HBSS in jede Vertiefung geben und dann die Platte auf das Mikroskop legen. Nachdem Sie die Anregungs- und Emissionsparameter für TMR und BODIPY nach Bedarf angepasst haben, erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von einem bis 15 Minuten, wie zuvor gezeigt. Bei der Messung des pH-Werts, oxidativer Ereignisse oder des Proteinabbaus in Makropinosomen kann die Dynamik der Versauerung nicht für einen bestimmten Zeitraum gemessen werden, der der Dextran-Ladephase entspricht, die je nach verwendetem Zelltyp variiert.Bei der Messung des Makropinosom-pH-Werts wird das Fluorescein-TMR-Verhältnis zunehmend kleiner und stagniert innerhalb von 15 Minuten nach der Erfassung. Dieses Plateau entspricht einem pH-Wert von etwa fünf, der in etwa dem pH-Wert von Lysosomen entspricht. Am Ende jeder Akquisition wird eine In-situ-Kalibrierung durchgeführt.Das Fluorescein-TMR-Verhältnis sollte innerhalb des Kalibrierpuffers bei pH 7,5 am größten sein und zunehmend kleiner werden, wenn die Kalibrierpuffer saurer werden. Dies ermöglicht die Erstellung einer Kalibrierkurve. Bei der Messung oxidativer Ereignisse in Makropinosomen wird das Verhältnis von H2DCFDA zu TMR zunehmend größer und wird wahrscheinlich innerhalb der ersten 20 bis 30 Minuten in einer aktivierten RAW264.7-Zellen ein Plateau erreichen.Bei der Messung der makropinosomalen Proteinverdauung wird ein progressiv starkes Fluoreszeinsignal freigesetzt, wenn das Ovalbumin verdaut wird. In RAW264.7-Zellen wird die Zunahme der Fluoreszenz, die aus dem verdauten BODIPY-markierten Ovalbumin freigesetzt wird, innerhalb der ersten 30 Minuten ein Plateau erreichen. Mit dieser aufstrebenden Rolle in der Homöostase und ihrer neu entdeckten Relevanz für die Krebspathologie ist derzeit eine Renaissance-Makropinozytoseforschung im Gange.Diese Methoden wurden einem Werkzeugkasten zur Verfügung gestellt, um den Beitrag der Makropinozytose zu diesen Studienbereichen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...