Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

אנו מודים לאוניברסיטת קלגרי על תמיכתה. ברצוננו גם להודות לד"ר רובין ייטס על הגישה לריגנטים, ציוד ודיונים שימושיים.

1. הכנת תאים
<ol><li>לגדול Raw264.7 תאים ב 37 °C ו 5% CO2 עד 70% השפעה ב RPMI בתוספת 10% סרום מומת בחום.</li>
	<li>יום אחד לפני ההסתערות, זרע Raw264.7 תאים בצפיפות של 5 x 104 תאים לבאר בצלחת 96-well. ודא כי כל באר מכילה 100 μL של אמצעי צמיחה. ודא כי צלחת 96 טוב יש צדדים שחורים ותחתית זכוכית להדמיה. הערה: כאן, לוחות 96-ב?...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

למרות שיש מספר פרוטוקולים למדידות תפוקה נמוכה וגבוהה של ספיגה מקרופינוציטית במקרופסגים, פיברובלסטים ואפילו Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,נעשו מעט מאוד ניסיונות למדוד את הביוכימיה הזוהרת של תאים דינמיים א?...

מקרופינוציטוזיס מתייחס לספיגת כמויות גדולות של נוזל חוץ-תאי לאברונים ציטופלסמיים הקשורים לממברנה הנקראים מקרופאינוזומים1,2. זהו תהליך שמור מאוד המבוצע על ידי אורגניזמים חד-תאיים חיים חופשיים, כגון אמבה דיקטיוסטליום spp. 3, כמו גם אנתוזואים4 ומטאזואנים2. ברוב התאים, מקרופינוציטוזיס הוא אירוע מושרה. קשירת קולטני פני התא גורמת לבולטות של הרחבות קרום פלזמה מונחות אקטין המכונות קפלים. חלק קטן מאותם קפלים, על ידי מנגנון לא מובן, לאטום את הטיפים הדיסטליים שלהם כדי ליצור macropinosomes (אם כי מעבר להיקף נייר שיטות זה, עבור ביקורות מפורטות על המכניקה של macropinocytosis, אנא עיין בהתייחסויות1,2,5,6,7). הגירוי החוץ תאי הגורמים למקרופינוציטוזיס הוא לרוב גורם גדילה מסיס5,8. בהתאם, האירוע המקרופינוציטי מאפשר בליעה של בולוס של חומר חוץ תאי שממנו התא יכול להפיק מטבוליטים שימושיים כדי להקל על הצמיחה. למרבה הצער, מסלול זה לאספקת חומרים מזינים יכול גם לנהוג פתולוגיה. תאים סרטניים מסוימים מכילים מוטציות שגורמות למקרופינוציטוזיס מתמשך או מהווה. המסירה המתמשכת של חומרים מזינים מקלה על התפשטות בלתי מבוקרת של תאים סרטניים ונקשרה לגידולים אגרסיביים במיוחד9,10,11,12,13. באופן דומה, וירוסים יכולים לגרום מקרופינוציטוזיס כדי לקבל גישה לתאים מארחים, ובכך לנהוגפתולוגיה ויראלית 14.
מקרופינוציטוזיס מתפקד גם בשמירה על חסינות לפתוגנים. תאים חיסוניים מולדים מסוימים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים עוסקים בדגימה מכוננת ואגרסיבית של נוזל חוץ תאי באמצעות מקרופינוציטוזיס6,15,16. מצב זה של מקרופינוציטוזיס פעיל להפליא, ותא דנדריטי יחיד יכול להסתגר בנפח של נוזל חוץ תאי השווה למשקל שלו כל שעה17. למרות הדגימה המכוננת הזו, מקרופאגים ותאים דנדריטיים אינם משתכפלים ללא שליטה כמו גם תאים סרטניים, במקום זאת, נראה שהם מעבדים את החומר החוץ תאי באופן שניתן לחלץ מידע כדי ליידע על נוכחות, או אכן היעדר, של איומים פוטנציאליים. מידע מופק כמו i) דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן שניתן לקרוא על ידי קולטני זיהוי פתוגן תאיים ii) קטעים קצרים של חומצות אמינו שניתן לטעון על מולקולות היסטו-תאימות גדולות להקרנה על ידי תאים של מערכת החיסון אדפטיבית16,18,19. לא ברור אם פתוגנים חתרים תחת מסלול זה לעיבוד מידע על ידי תאי מערכת החיסון.
למרות תפקידים מוגדרים היטב וביקורתיים אלה עבור macropinocytosis הן בשמירה על חסינות הומאוסטזיס ובניגוד למצבים אחרים הנחקרים יותר של אנדוציטוזיס, מעט מהעבודה הפנימית (הזוהרת) של מקרופאינוזומים ידועה. פיתוח פרוטוקולים וכלים סטנדרטיים לחקר הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינוזומים לא רק יעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה הייחודית שלהם, אלא יספק תובנה שניתן למנף לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כולל אספקת תרופות20. שיטה זו תתמקד בכלים שפותחו לאחרונה לנתח, ברמת האברונים הבודדים, היבטים שונים של הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינום.
פלואורופורים יכולים לשמש למדידת ביוכימיה ספציפית של אברונים אם i) הם מחולקים באופן מועדף לתוך תא העניין ו /או ii) הם עוברים שינויים ספקטרליים בתגובה לפרמטר העניין. לדוגמה, במקרה של pH, בסיסים חלשים פלואורסצנטיים, כגון כתום אקרידן, סגול סהר, וצבעי LysoTracker מצטברים באופן מועדף אברונים חומציים. לכן, העוצמה היחסית שלהם היא אינדיקציה גסה כי אברון שכותרתו חומצית. פלואורופורים אחרים בעלי תגובה ל-pH, כגון פלואורסצין, pHrodo ו-cypHer5e, עוברים שינויים ספקטרליים עם קשירה לפרוטונים(איור 1A-C). שינויים בפליטת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים רגישים ל- pH יכולים אפוא לספק קירוב שימושי של pH. השימוש בפלואורופור יחיד, לעומת זאת, מציג מספר חסרונות. לדוגמה, שינויים במישור המוקד, ההלבנה והשינויים בנפח של אברונים בודדים, תופעה שכיחה במקרופינוזומים21, יכולים לגרום לשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופור יחיד, ולא ניתן לתקן זאת בקלות עבור22. הערכות אורך גל יחיד, אם כי שימושי להדמיה תאים חומציים, ולכן הם איכותיים לחלוטין.
גישה כמותית יותר היא למקד את הפלורופור הרגיש לפרמטר יחד עם פלואורופור התייחסות לאברון העניין. פלואורופור הייחוס הוא באופן אידיאלי חסר רגישות לשינויים ביוכימיים בתוך האברונים (איור 1D-F) ולכן ניתן להשתמש בו כדי לתקן שינויים במישור המוקד, נפח organellar, ובמידה מסוימת, צילום23. באמצעות גישה זו, המכונה פלואורסצנטיות יחסית פלואורופור כפולה, ניתן להשיג תיקון על ידי יצירת יחס של פליטת פלואורסצנטיות של פלואורופור רגיש לפרמטרים לפלואורופור הייחוס.
כאן, הפרוטוקול יהיה ניצול העיקרון של הדמיה יחס פלואורופור כפול כדי למדוד pH, אירועים חמצוניים, השפלת חלבון בתוך מקרופאינוזומים. בכל מקרה, פלואורופור ייבחר כי הוא רגיש לפרמטר של עניין פלואורופור התייחסות. על מנת למקד את הפלורופורים במיוחד למקרופאינוזומים, הם יהיו יחד בשיתוף עם 70 kDa dextran, אשר משולב באופן מועדף מקרופאינוזומים24. כל ההסתה תבוצע בתאי Raw264.7 אך ניתן להתאיםן לסוגי תאים אחרים. במידת האפשר, יחסי הפלואורסצנטיות כוילו כנגד עקומת ייחוס כדי להשיג ערכים מוחלטים. חשוב לציין, כל המדידות יבוצעו בתאים חיים להערכה דינמית וכמותית של הסביבה הזוהרת של מקרופאינום.
בעת בחירת פלואורופורים רגישים ל- pH, יש לשקול מספר שיקולים. הראשון הוא pKa של הפלורופור, אשר מציין את הטווח של ערכי pH שבו הבדיקה תהיה רגישה ביותר. אם ההנחה היא כי זמן קצר לאחר היווצרות, ה- pH של macropinosome יהיה קרוב לזה של המדיום החוץ תאי (~ pH 7.2) וכי הוא יהיה חומצי בהדרגה באמצעות אינטראקציות עם אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים (~ pH 5.0), אז בדיקה עם pKa כי הוא רגיש בטווח זה (איור 2C) יש לבחור. פלואורופור פלואורסצ'ין, שיש לו pKa של 6.4, רגיש באופן אופטימלי בטווח זה. זה שימש בהרחבה כדי למדוד אברונים דומים אחרים, כגון phagosomes, ויהיה פלואורופור של בחירה בכתב יד זה22,25. כפלואורופור התייחסות, ייעשה שימוש בטטרםאתיל-רדואמין, דבר שאינו רגיש ל-pH (איור 1E). פלואורופורים אחרים, כגון pHrodo ו cypHer5e עשויים להיות מוחלפים פלואורסצין שבו המאפיינים הספקטרליים של פלואורסצין אכן תואמים משתנים ניסיוניים אחרים. כמה פלואורופורים התייחסות הציע עבור pHrodo ו cypHer5e מוצגים באיור 1.
שיקול שני הוא השיטה שבאמצעותה שני הפלורופורים יכוונו במיוחד למקרופאינוזום. דקסטרן בגודל 70 kDa, בעל רדיוס הידרודינמי של כ-7 ננומטר, אינו נדבק באופן לא ספציפי לתאים ומשולב במקרופינומים, אך לא בורות או מערות מצופים קלאתרין, ולכן מסמן מקרופאינומים (איור 2A ואיור 3A, B)16,24,26. בפרוטוקול זה, פלואורסציין שכותרתו 70 kDa dextran ו tetramethylrhodamine (TMR)-שכותרתו 70 kDa dextran ישמשו בדיקות רגיש pH וייחוס, בהתאמה.
בתאי מערכת החיסון המולדים, מקרופינוציטוזיס ופגוציטוזיס מייצגים את שני המסלולים העיקריים להפנמה של חומר אקסוגני לעיבוד והצגה לאחר מכן לתאים של התגובה החיסונית המסתגלת27. השליטה הקפדנית והמתואמת של הכימיה האדומה של הלומן של פאגוזומים ומקרופינוזומים היא קריטית לעיבוד ספציפי להקשר של חומר אקסוגני. אולי הרגולטור הנחקר ביותר של אירועים חמצוניים בפגוזומים הוא אוקסידאז NADPH, קומפלקס רב-תת-קרקעי גדול המייצר כמויות גדולות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בתוך הלומן של פאגוזומים28. ואכן, פעילותה היא מרכזית לעיבוד אנטיגן מתאים בתוך phagosomes29,30. עם זאת, הפעילות של אוקסידאז NADPH על ממברנות macropinosomal לא נחקרה.
בפרוטוקול זה, אסתר הסוצ'ינימידיל H2DCFDA משמשת למדידת אירועים חמצוניים בתוך המקרופאינוזום. זוהי צורה שונה של פלואורסצ'ין (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate), שהוא פלואורסצנטי מינימלי בצורתו המופחתת. לאחר חמצון, פליטת הפלואורסצנטיות שלו עולה באופן משמעותי. עם זאת, ראוי לציין אזהרה משמעותית של H2DCFDA - כפי שהוא מבוסס על פלואורופור פלואורסצין, הפלואורסצנטיות שלו מרווה גם בתאים חומציים, ויש לנקוט זהירות כדי לשלוט על משתנה זה בעת תכנון ניסויים28. בדומה לגישה למדידת pH, אסתר הסוצ'ינימידיל H2DCFDA תוצמד באופן קוולנטי ל- 70 kDa dextran ו- Dextran עם תווית TMR 70 kDa ישמשו כפזור הייחוס (איור 3A).
אובלבומין פלואורסצנטי ישמש למדידת ירידה בחלבון בתוך מקרופאינוזומים. הסגלגל המשמש כאן מסומן בצפיפות עם 4,4-difluoro-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-indacene (BODIPY) FL כי הוא מרווה את עצמו. עם העיכול, פפטידים בצבע פלואורסצנטי חזק משוחררים. כמו אליבאמין לא ניתן להטות בקלות ל 70 kDa dextran, תאים עם TMR מסומן 70 kDa dextran ו אובלבומין שלב נוזל יהיה דגירה משותפת. אות ה-TMR ישמש ליצירת מסכת מקרופאינום במהלך ניתוח שלאחר ההדמיה, והאות המשתחרר מהסגלגל המעוכל יימדד בתוך המסכה (איור 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

בשנים האחרונות, תחום המקרופינוציטוזיס גדל במהירות. מקרופינוציטוזיס התפתח כמנגנון מרכזי שבאמצעותו תאי מערכת החיסון המולדים שומרים על הומאוסטזיס אורגניזם וחסינות. בו זמנית, ובניגוד לתפקידו ההומיאוסטטי, הוא יכול גם לנהוג בפתולוגיות שונות, כולל סרטן וזיהומים ויראליים. שלא כמו מצבים אחרים של אנדוציטוזיס, הכלים שפותחו לחקר ההתבגרות של מקרופאינוזום נשארים לא מפותחים. כאן הפרוטוקול מתאר כלים שפותחו לאחרונה לחקר סביבת redox בתוך הלומן של מקרופאינום מוקדמים ומבשרים. מתודולוגיות לשימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות יחסרית בהערכת ה- pH, ייצור מיני חמצן תגובתי ויכולת השפלה בתוך הלומן של מקרופאינוזומים בודדים בתאים חיים מתוארים. מדידות אברונים בודדות מציעות את היתרון של חשיפת הטרוגניות מרחבית, אשר לעתים קרובות הולך לאיבוד עם גישות מבוססות אוכלוסייה. הדגש מושם על העקרונות הבסיסיים של מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה, כולל בחירת בדיקה, מכשור, כיול ושיטות חד-תאיות לעומת שיטות מבוססות אוכלוסייה.

בעת מדידת pH macropinosome, יש פרק זמן שבו הדינמיקה של החמצה לא ניתן למדוד. תקופה זו תואמת לשלב הטעינה של dextran (תיבה אפורה באיור 2C ובאיור 3C,D) ותשתנה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש. אורך שלב הטעינה ישתנה עם (i) הפעילות המקרופינוציטית של התאים ו- (ii) הרגישות של המכש...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

אנו מתארים פרוטוקולים למדידת pH, אירועים חמצוניים ועיכול חלבונים במקרופינוזומים בודדים בתאים חיים. דגשושם על מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה ועל היתרונות שהיא מציעה על פני טכניקות מבוססות אוכלוסייה.

מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

פרוטוקול זה מאפשר הערכה בזמן אמת של תהליכים שונים ופרמטרים ביוכימיים בתוך לומן של מקרופאינום בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש לגילוי סמים בביולוגיה התאית של מקרופינוציטוזיס. פרוטוקול זה מספק את היתרון של חשיפת הטרוגניות הן ברמת התא והן ברמת האברונים.יום אחד לפני הזרעים Raw264.7 תאים בצפיפות של חמש פעמים 10 לכוח של התאים ב 100 microliters לבאר, בצלחת 96-באר תחתון זכוכית עם צדדים שחורים. ביום הבדיקה בדוק אם בארות הם לפחות 70% מפגש. לאחר מכן לשטוף את כל בארות עם 100 microliters של HBSS, מתוכנן מראש ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של HBSS המכיל 0.025 מיליגרם למיליליטר של TMR שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן ו 0.025 מיליגרם של פלואורסצין שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן בכל באר, ולאחר מכן לדגור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר הדגירה הושלמה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור לשטוף את התאים שש פעמים עם 100 microliters של HBSS. לאחר הכביסה האחרונה להוסיף 100 microliters של HBSS מחמם מראש לתאים ואז למקם את הצלחת על מיקרוסקופ עם במה מחוממת ותא.לאחר התאמת הפרמטרים עירור ופליטה עבור TMR ופלואורסצין לפי הצורך, לרכוש תמונה מכל באר לסירוגין בין שני פלואורופורים בין כל באר. לאחר הרכישה הראשונה, בדוק אם כל הבארות נשארו בפוקוס על פני הצלחת כולה, ולאחר מכן לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של דקה עד 15 דקות למשך הזמן הרצוי. במהלך רכישת התמונה, להתאים את ה- pH של 50 מיליליטר aliquot של תמיסה עשירה באשלגן חוצץ עם HEPES 25 מילימולרי ל 7.5 באמצעות 10 חומצה הידרוכלורית טוחנת, או 10 אשלגן הידרוקסיד טוחנת לפי הצורך.לאחר מכן להתאים את ה- pH של 350 מיליליטר aliquots של פתרון עשיר באשלגן חוצץ עם 25 מילימולר MES ל pH 6.5, pH 5.5 ו- pH 5.0. לאחר השלמת רכישת התמונה, הסר את HBSS מהצלחת 96-well המכילה את התאים והוסף את הפתרון העשיר באשלגן ב- pH 7.5. לאחר מכן להוסיף ניז'ריצ'רין בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר.הנח את הצלחת בחזרה על המיקרוסקופ ולרכוש תמונות של כל באר באמצעות אותן הגדרות רכישה כפי שהוכח בעבר. כדי למדוד אירועים חמצוניים בתוך macropinosomes, זרע RAW264.7 תאים בצלחת 96 באר יום אחד לפני ההסתה כפי שהוכח בעבר. ואז ביום של אסאי לשטוף את כל בארות עם 100 microliters של HBSS מראש מחמם ל 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של HBSS המכיל 0.025 מיליגרם למיליליטר של TMR שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן ו 0.025 מיליגרם למיליליטר של H2DCFDA שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן לכל באר, ולאחר מכן לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר הסרת הצלחת מן האינקובטור לשטוף את התאים שש פעמים עם 100 microliters של HBSS. לאחר הכביסה האחרונה, להוסיף 100 microliters של HBSS לכל באר ומניחים את הצלחת על המיקרוסקופ.לאחר התאמת פרמטרי העירור והפליטה עבור TMR ו- H2DCFDA לפי הצורך, לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של דקה עד 15 דקות כפי שהודגם בעבר. כדי למדוד עיכול חלבונים בתוך מקרופאינוזומים, זרע RAW264.7 תאים יום אחד לפני ההסתה, כפי שהוכח בעבר. ואז ביום של בדיקות לשטוף את כל בארות עם 100 microliters של HBSS מראש מתוכנן מראש ב 37 מעלות צלזיוס.הבא להוסיף 100 microliters של HBSS המכיל 0.025 מיליגרם למיליליטר של TMR שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן ב 0.2 מיליגרם למיליליטר BODIPY שכותרתו אלילבומין לכל באר. ואז לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר הסרת התאים מן האינקובטור, לשטוף אותם שש פעמים עם 100 microliters של HBSS.לאחר הכביסה האחרונה להוסיף 100 microliters של HBSS לכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת על המיקרוסקופ. לאחר התאמת פרמטרי העירור והפליטה עבור TMR ו- BODIPY לפי הצורך, לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של דקה עד 15 דקות כפי שהודגם בעבר. בעת מדידת ה- pH, אירועים חמצוניים או השפלת חלבונים במקרופינוזומים, לא ניתן למדוד את הדינמיקה של החמצה לפרק זמן מסוים המתאים לשלב הטעינה של דקסטרן, המשתנה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש.בעת מדידת ה- pH של המקרופאינום, יחס הפלואורסין ל- TMR יהפוך בהדרגה לקטן יותר ויתייצב בתוך 15 דקות הרכישה. רמה זו תואמת pH של כחמישה, אשר בערך תואם את ה- pH של ליזוזומים. בסוף כל רכישה, כיול In situ מבוצע.יחס הפלואורסין ל- TMR צריך להיות הגדול ביותר בתוך מאגר הכיול ב- pH 7.5 ולהיות קטן יותר בהדרגה ככל שמאגרי הכיול הופכים לחומציים יותר. זה מאפשר יצירת עקומת כיול. בעת מדידת אירועים חמצוניים בתוך macropinosomes, היחס בין H2DCFDA ל- TMR יהיה גדול יותר בהדרגה וסביר להניח רמה בתוך 20 עד 30 הדקות הראשונות בתאי RAW264.7 מופעלים.בעת מדידת עיכול חלבון macropinosomal, אות פלואורסצ'ין חזק בהדרגה ישוחרר כמו הסגלגל מתעכל. בתאי RAW264.7, העלייה בפלואורסצנטיות המשתחררת מה- Ovalbumin המעוכל של BODIPY, תעלה בתוך 30 הדקות הראשונות. עם התפקיד המתהווה הזה בהומיאוסטזיס וזה רלוונטי לאחרונה לפתולוגיה של סרטן, מחקר מקרופינוציטוזיס רנסנס נמצא בעיצומו.שיטות אלה מסופקות לארגז כלים לבחינת תרומתו של מקרופינוציטוזיס לתחומי מחקר אלה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Assay חינם Cell מערכת הערכת קיבולת נטרול של נוגדן GM-CSF באמצעות קולטן מסיס רקומביננטי GM-CSF

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...