Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
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हम इसके समर्थन के लिए कैलगरी विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ रॉबिन येट्स को भी अभिकर् स, उपकरण और उपयोगी चर्चाओं तक पहुंच के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

1. कोशिकाओं की तैयारी
<ol><li>37 डिग्री सेल्सियस पर Raw264.7 कोशिकाओं और 5% सीओ2 से 70% की घुल-मिलन आरपीएमआई में 10% गर्मी-निष्क्रिय सीरम के साथ पूरक हो जाना।</li>
	<li>परख से एक दिन पहले, एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में 5 x 104 को...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

यद्यपि मैक्रोफेज, फाइब्रोब्लास्ट और यहां तक कि डिक्टियोस्टियम स्पीप में मैक्रोपिनोसाइटिक तेज के कम और उच्च थ्रूपुट दोनों मापों के लिए कई प्रोटोकॉल हैं। 3,7,31,</sup...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

हाल के वर्षों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का क्षेत्र तेजी से बढ़ा है । मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक केंद्रीय तंत्र के रूप में उभरा है जिसके द्वारा जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं संगठित होमोस्टेसिस और प्रतिरक्षा को बनाए रखते हैं। साथ ही, और इसकी होम्योस्टेटिक भूमिका के विपरीत, यह कैंसर और वायरल संक्रमण सहित विभिन्न विकृतियों को भी चला सकता है। एंडोसाइटोसिस के अन्य साधनों के विपरीत, मैक्रोपिनोसोम्स की परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए विकसित उपकरण अविकसित रहते हैं। यहां प्रोटोकॉल जल्दी और परिपक्व मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर रेडॉक्स वातावरण का अध्ययन करने के लिए नए विकसित उपकरणों का वर्णन करता है। पीएच का आकलन करने में अनुपातमेट्रिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के तरीके, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन, और जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर डिग्रेडिव क्षमता का वर्णन किया गया है। एकल ऑर्गेनेल माप स्पिटियोटेम्परल विषमता का खुलासा करने का लाभ प्रदान करते हैं, जो अक्सर जनसंख्या आधारित दृष्टिकोणों के साथ खो जाता है। दोहरी फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी के बुनियादी सिद्धांतों पर जोर दिया जाता है, जिसमें जांच चयन, इंस्ट्रूमेंटेशन, अंशांकन और एकल-कोशिका बनाम जनसंख्या आधारित तरीके शामिल हैं ।

मैक्रोपिनोसोम पीएच को मापते समय, समय की अवधि होती है जिसके लिए अम्लीकरण की गतिशीलता को मापा नहीं जा सकता है। यह अवधि डेक्सट्रान लोडिंग चरण (चित्रा 2सी और चित्रा 3सी, डीमें ग्रे बॉक्स) से ...

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Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

हम जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम्स में पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं और प्रोटीन पाचन को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। दोहरी फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी और जनसंख्या आधारित तकनीकों पर यह लाभ प्रदान करने पर जोर दिया जाता है।

ड्यूल-फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीएच, रेडॉक्स रसायन और मैक्रोपिनोसोम की डिग्रेडिव क्षमता को मापना

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर विभिन्न प्रक्रियाओं और जैव रासायनिक मापदंडों के वास्तविक समय के आकलन के लिए अनुमति देता है। इन तरीकों को मैक्रोपिनोसाइटोसिस के सेल बायोलॉजी में दवा की खोज के लिए नियोजित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल सेलुलर और ऑर्गेनेल दोनों स्तरों पर विषमता का खुलासा करने का लाभ प्रदान करता है।परख बीज Raw264.7 कोशिकाओं से पहले पांच गुना 10 के घनत्व पर १०० माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की शक्ति के लिए, एक गिलास नीचे ९६ में अच्छी तरह से काले पक्षों के साथ थाली । परख के दिन जांच करें कि क्या कुएं कम से ७०% ढुलमुल हैं । फिर सभी कुओं को एचबीएसएस के १०० माइक्रोलीटर से धोएं, जो ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्ववार्म किया गया है ।इसके बाद, टीएमआर लेबल के 0.025 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर वाले एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें 70 किलोडलटन डेक्सट्रान और 0.025 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर फ्लोरोसिन लेबल प्रत्येक कुएं में 70 किलोडलटन डेक्सट्रान, फिर 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद इनक्यूबेटर से प्लेट निकाल लें और एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर से छह बार कोशिकाओं को धोएं। अंतिम धोने के बाद कोशिकाओं को प्रीवार्मेड एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें फिर प्लेट को एक गर्म चरण और कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप पर रखें।आवश्यकतानुसार टीएमआर और फ्लोरोसीन के लिए उत्तेजन और उत्सर्जन मापदंडों को समायोजित करने के बाद, प्रत्येक कुएं के बीच में दो फ्लोरोफोरस के बीच प्रत्येक अच्छी तरह से बारी से एक छवि प्राप्त करें। पहले अधिग्रहण के बाद, जांच करें कि क्या सभी कुएं पूरी प्लेट में ध्यान केंद्रित कर रहे थे, फिर वांछित समय की वांछित लंबाई के लिए एक से 15 मिनट के अंतराल पर प्रत्येक कुएं की छवियों को प्राप्त करते हैं। छवि अधिग्रहण के दौरान, 10 मोलर हाइड्रोक्लोरिक एसिड, या 10 मोलर पोटेशियम हाइड्रोक्साइड की आवश्यकता का उपयोग करके 25 मिलीमोलर एचईपीई के साथ 7.5 तक बफर पोटेशियम समृद्ध समाधान के 50 मिलीलीटर एलिकोट के पीएच को समायोजित करें।फिर पोटेशियम समृद्ध समाधान के 350 मिलीलीटर एलिकोट्स के पीएच को पीएच 6.5, पीएच 5.5 और पीएच 5.0 में 25 मिलीमोलर एमईएस के साथ समायोजित करें। एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो जाने के बाद, कोशिकाओं वाले 96-अच्छी प्लेट से एचबीबीएस को हटा दें और पीएच 7.5 पर पोटेशियम समृद्ध समाधान जोड़ें। फिर 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर नाइजरिकिन जोड़ें।प्लेट को माइक्रोस्कोप पर वापस रखें और पहले प्रदर्शित समान अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें। मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं को मापने के लिए, पहले प्रदर्शन के रूप में परख से एक दिन पहले एक ९६-अच्छी थाली में बीज RAW264.7 कोशिकाओं । फिर परख के दिन सभी कुओं को एचबीएसएस के १०० माइक्रोलीटर के साथ धोकर ३७ डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म्ड कर दिया ।इसके बाद, टीएमआर लेबल के 0.025 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर वाले एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें 70 किलोडलटन डेक्सट्रान और 0.025 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर एच2डीसीएफडीए ने प्रत्येक कुएं में 70 किलोडलटन डेक्सट्रान लेबल किया, फिर कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया। इनक्यूबेटर से प्लेट हटाने के बाद कोशिकाओं को एचबीएसएस के 100 माइक्रोलीटर से छह बार धोएं। आखिरी वॉश के बाद हर कुएं में एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर डालें और प्लेट को माइक्रोस्कोप पर रखें।आवश्यकतानुसार टीएमआर और एच2डीसीएफडीए के लिए उत्तेजन और उत्सर्जन मापदंडों को समायोजित करने के बाद, पहले के अनुसार एक से 15 मिनट के अंतराल पर प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें। मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर प्रोटीन पाचन को मापने के लिए, परख से एक दिन पहले RAW264.7 कोशिकाओं को बीज, जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था। फिर परख के दिन सभी कुओं को एचबीएसएस के १०० माइक्रोलीटर के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म्ड करते हैं ।इसके बाद टीएमआर के 0.025 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर वाले एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो प्रत्येक कुएं में 0.2 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बॉडीपीई लेबल वाले 70 किलोडलटन डेक्सट्रान में लेबल किया गया है। इसके बाद थाली को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने के बाद उन्हें एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर से छह बार धोएं।आखिरी वॉश के बाद प्रत्येक कुएं में एचबीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर प्लेट को माइक्रोस्कोप पर रखें। आवश्यकतानुसार टीएमआर और बॉडीपीवाई के लिए उत्तेजन और उत्सर्जन मापदंडों को समायोजित करने के बाद, पहले के अनुसार एक से 15 मिनट के अंतराल पर प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें। मैक्रोपिनोसोम्स में पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं या प्रोटीन क्षरण को मापने पर, एसिडिफिकेशन की गतिशीलता को डेक्सट्रान लोडिंग चरण के अनुरूप एक निश्चित समय अवधि के लिए मापा नहीं जा सकता है, जो उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होता है।मैक्रोपिनोसोम पीएच को मापने के दौरान, टीएमआर अनुपात में फ्लोरोसिन उत्तरोत्तर छोटा हो जाएगा और अधिग्रहण के 15 मिनट के भीतर पठार होगा। यह पठार लगभग पांच के पीएच से मेल खाता है, जो मोटे तौर पर लाइसोसोम्स के पीएच से मेल खाता है। प्रत्येक अधिग्रहण के अंत में, एक सीटू अंशांकन किया जाता है।टीएमआर अनुपात में फ्लोरोसेइन पीएच 7.5 पर अंशांकन बफर के भीतर सबसे बड़ा होना चाहिए और उत्तरोत्तर छोटा हो जाना चाहिए क्योंकि अंशांकन बफर अधिक अम्लीय हो जाते हैं। यह एक अंशांकन वक्र की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं को मापने पर, एच2डीसीएफडीए का टीएमआर के अनुपात उत्तरोत्तर बड़ा हो जाएगा और एक सक्रिय RAW264.7 कोशिकाओं में पहले 20 से 30 मिनट के भीतर पठार की संभावना होगी ।मैक्रोपिनोसोमल प्रोटीन पाचन को मापने पर, एक उत्तरोत्तर मजबूत फ्लोरोसेइन संकेत मुक्त हो जाएगा क्योंकि अंडाकार पचा जाता है। RAW264.7 कोशिकाओं में, पचा BODIPY लेबल अंडाकार से मुक्त फ्लोरेसेंस में वृद्धि, पहले 30 मिनट के भीतर पठार होगा । होमोसटासिस में इस उभरती भूमिका के साथ और यह कैंसर विकृति के लिए नई खोज प्रासंगिकता है, एक पुनर्जागरण मैक्रोपिनोसाइटोसिस अनुसंधान वर्तमान में चल रहा है ।इन तरीकों ने अध्ययन के इन क्षेत्रों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस के योगदान की खोज के लिए एक उपकरण बॉक्स को प्रदान किया।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

एक फ्री सेल परख जीएम-CSF एंटीबॉडी के उदासीन क्षमता का आकलन प्रणाली पुनः संयोजक घुलनशील रिसेप्टर जीएम-CSF का उपयोग

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

माउस 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग thymus के intravital इमेजिंग

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

चूहे में स्थानीय तीव्रग्राहिता मापने

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

का विश्लेषण<em&gt; यर्सीनिया enterocolitica</emमेजबान कोशिकाओं में&gt; प्रेरक translocation बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक Fusions का उपयोग

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

मापने की शारीरिक प्रतिक्रियाओं<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लिपिड फेरोमोंस के लिए संवेदी न्यूरॉन्स लाइव कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Ratiometric प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा फेगोसोम पीएच मापने

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

चिकित्सकीय biofilms में कोशिकी पीएच की ratiometric इमेजिंग

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

न्युट्रोफिल फेगोसोम इमेजिंग और कोशिका द्रव्य एक Ratiometric पीएच संकेतक का उपयोग करना

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...