Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Ringraziamo l'Università di Calgary per il suo sostegno. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Robin Yates per l'accesso a reagenti, attrezzature e discussioni utili.

1. Preparazione delle cellule
<ol><li>Coltiva cellule Raw264.7 a 37 °C e dal 5% di CO2 al 70% di confluenza in RPMI integrato con il 10% di siero inattivato dal calore.</li>
	<li>Un giorno prima del test, seminare raw264,7 cellule ad una densità di 5 x 104 cellule per pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzo contenga 100 μL di terreno di coltura. Assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti abbia lati neri e un fondo di vetro per l'imaging. NOTA: Qui, le piastre a 96 poz...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

Sebbene esistano numerosi protocolli per misurazioni sia a basso che ad alto rendimento dell'assorbimento macropinocitico in macrofagi, fibroblasti e persino Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,pochissimi tentativi sono stati fatti per misurare la biochimica luminale di questi compartimenti dinamici. Ciò è probabilmente dovuto a una scarsità di sonde c...

La macropinocitosi si riferisce all'assorbimento di grandi quantità di fluido extracellulare in organelli citoplasmatici legati alla membrana chiamati macropinosomi1,2. È un processo altamente conservato eseguito da organismi unicellulari viventi liberi, come l'ameba Dictyostelium spp. 3, così come antozoi4 e metazoi2. Nella maggior parte delle cellule, la macropinocitosi è un evento indotto. La legatura dei recettori della superficie cellulare induce la protrusione delle estensioni della membrana plasmatica guidate dall'actina denominate volant. Una frazione di questi volant, da qualche meccanismo poco compreso, sigillano le loro punte distali per formare macropinosomi (anche se al di là dello scopo di questo documento di metodi, per revisioni dettagliate sulla meccanica della macropinocitosi, si prega di fare riferimento ai riferimenti1,2,5,6,7). Lo stimolo extracellulare che induce la macropinocitosi è più spesso un fattore di crescita solubile5,8. Di conseguenza, l'evento macropinocitico consente l'ingestione di un bolo di materiale extracellulare da cui la cellula può ricavare metaboliti utili per facilitare la crescita. Sfortunatamente, questo percorso per la consegna dei nutrienti può anche guidare la patologia. Alcune cellule tumorali ospitano mutazioni che provocano macropinocitosi continua o costitutiva. L'erogazione continua di nutrienti facilita la proliferazione incontrollata delle cellule tumorali ed è stata collegata a tumori particolarmente aggressivi9,10,11,12,13. Allo stesso modo, i virus possono indurre macropinocitosi per ottenere l'accesso alle cellule ospiti, guidando così la patologia virale14.
La macropinocitosi funziona anche nel mantenimento dell'immunità agli agenti patogeni. Alcune cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche si impegnano nel campionamento costitutivo e aggressivo del fluido extracellulare tramite macropinocitosi6,15,16. Questa modalità di macropinocitosi è incredibilmente attiva e una singola cellula dendritica può inglobarsi con un volume di liquido extracellulare equivalente al proprio peso ogni ora17. Nonostante questo campionamento costitutivo, i macrofagi e le cellule dendritiche non si replicano in modo incontrollabile come fanno le cellule tumorali, ma sembrano elaborare il materiale extracellulare in modo tale che le informazioni possano essere estratte per informare sulla presenza, o addirittura sull'assenza, di potenziali minacce. Le informazioni vengono estratte come i) modelli molecolari associati ai patogeni che possono essere letti dai recettori di riconoscimento dei patogeni intracellulari e ii) brevi tratti di amminoacidi che possono essere caricati sulle principali molecole di istocompatibilità per lo screening da parte delle cellule del sistema immunitario adattativo16,18,19. Se i patogeni sovvertono questo percorso per l'elaborazione delle informazioni da parte delle cellule immunitarie non è al momento chiaro.
Nonostante questi ruoli ben definiti e critici per la macropinocitosi sia nel mantenimento dell'immunità che nell'omeostasi e in contrasto con altre modalità di endocitosi più comunemente studiate, si sa poco del funzionamento interno (luminale) dei macropinosomi. Lo sviluppo di protocolli e strumenti standardizzati per studiare la biochimica luminale dei macropinosomi non solo ci aiuterà a comprendere meglio la loro biologia unica, ma fornirà informazioni che possono essere sfruttate per nuove strategie terapeutiche, tra cui la somministrazione di farmaci20. Questo metodo manoscritto si concentrerà su strumenti recentemente sviluppati per sezionare, a livello di singolo organello, vari aspetti della biochimica luminale dei macropinosomi.
I fluorofori possono essere utilizzati per misurare specifiche biochimiche di organelli se i) si dividono preferenzialmente nel compartimento di interesse e/o ii) subiscono cambiamenti spettrali in risposta al parametro di interesse. Ad esempio, nel caso del pH, le basi deboli fluorescenti, come l'arancio acridina, il viola cresile e i coloranti LysoTracker si accumulano preferenzialmente negli organelli acidi. Pertanto, la loro intensità relativa è un'indicazione approssimativa che l'organello etichettato è acido. Altri fluorofori pH-responsive, come fluoresceina, pHrodo e cypHer5e, subiscono cambiamenti spettrali al momento del legame ai protoni (Figura 1A-C). Le modifiche all'emissione di fluorescenza dei fluorofori sensibili al pH possono quindi fornire un'utile approssimazione del pH. L'uso di singoli fluorofori, tuttavia, presenta una serie di svantaggi. Ad esempio, le modifiche al piano focale, il fotosciviazione e le modifiche al volume dei singoli organelli, un evento comune nei macropinosomi21, possono indurre cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei singoli fluorofori e questo non può essere facilmente corretto per22. Le valutazioni a singola lunghezza d'onda, sebbene utili per visualizzare compartimenti acidi, sono quindi puramente qualitative.
Un approccio più quantitativo consiste nell'indirizzare il fluoroforo sensibile ai parametri insieme a un fluoroforo di riferimento all'organello di interesse. Il fluoroforo di riferimento è idealmente insensibile ai cambiamenti biochimici all'interno dell'organello (Figura 1D-F) e può quindi essere utilizzato per correggere i cambiamenti nel piano focale, nel volume organellare e, in una certa misura, nel fotosableaching23. Utilizzando questo approccio, denominato fluorescenza del doppio fluoroforo, la correzione può essere ottenuta generando un rapporto tra l'emissione di fluorescenza del fluoroforo sensibile ai parametri e il fluoroforo di riferimento.
Qui, il protocollo utilizzerà il principio dell'imaging ratiometrico a doppio fluoroforo per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la degradazione delle proteine all'interno dei macropinosomi. In ogni caso, verrà selezionato un fluoroforo sensibile al parametro di interesse e un fluoroforo di riferimento. Al fine di indirizzare i fluorofori specificamente ai macropinosomi, saranno accoppiati covalentemente a 70 kDa destrano, che è preferibilmente incorporato nei macropinosomi24. Tutti i test saranno eseguiti in cellule Raw264.7 ma possono essere adattati ad altri tipi di cellule. Ove possibile, i rapporti di fluorescenza saranno calibrati rispetto a una curva di riferimento per ottenere valori assoluti. È importante sottolineare che tutte le misurazioni saranno eseguite in cellule vive per la valutazione dinamica e quantitativa dell'ambiente luminale dei macropinosomi.
Quando si selezionano fluorofori sensibili al pH, è necessario valutare una serie di considerazioni. Il primo è il pKa del fluoroforo, che indica l'intervallo di valori di pH a cui la sonda sarà più sensibile. Se si presume che poco dopo la formazione, il pH del macropinosoma sarà vicino a quello del mezzo extracellulare (~pH 7,2) e che si acidificherà progressivamente attraverso interazioni con endosomi e lisosomi tardivi (~pH 5,0), allora dovrebbe essere selezionata una sonda con un pKa sensibile all'interno di tale intervallo (Figura 2C). La fluoroforo fluoresceina, che ha un pKa di 6,4, è sensibile in modo ottimale all'interno di tale intervallo. È stato ampiamente utilizzato per misurare altri organelli simili, come i fagosomi, e sarà il fluoroforo di scelta in questo manoscritto22,25. Come fluoroforo di riferimento, verrà utilizzata la tetrametilrodamina, che è insensibile al pH (Figura 1E). Altri fluorofori, come pHrodo e cypHer5e possono essere sostituiti dalla fluoresceina in cui le proprietà spettrali della fluoresceina corrispondono ad altre variabili sperimentali. Alcuni fluorofori di riferimento suggeriti per pHrodo e cypHer5e sono mostrati nella Figura 1.
Una seconda considerazione è il metodo con cui i due fluorofori saranno mirati specificamente ai macropinosomi. Il destrano della dimensione 70 kDa, che ha un raggio idrodinamico di circa 7 nm, non si attacca in modo non specifico alle cellule ed è incorporato nei macropinosomi, ma non nelle fosse rivestite di clatrina o nelle caveole, e quindi segna i macropinosomi (Figura 2A e Figura 3A, B)16,24,26. In questo protocollo, il destro di destrano e la tetrametilrodamina (TMR) etichettati con fluoresceina da 70 kDa saranno utilizzati rispettivamente come sonde sensibili al pH e di riferimento.
Nelle cellule immunitarie innate, la macropinocitosi e la fagocitosi rappresentano le due principali vie per l'internalizzazione del materiale esogeno per l'elaborazione e la successiva presentazione alle cellule della risposta immunitaria adattativa27. Il controllo attento e coordinato della chimica redox del lume di fagosomi e macropinosomi è fondamentale per l'elaborazione specifica del contesto del materiale esogeno. Forse il regolatore più studiato degli eventi ossidativi nei fagosomi è la NADPH ossidasi, un grande complesso multi-subunità che produce grandi quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume dei fagosomi28. Infatti, la sua attività è fondamentale per l'appropriata elaborazione dell'antigene all'interno dei fagosomi29,30. Tuttavia, l'attività della NADPH ossidasi sulle membrane macropinosomiali non è stata esplorata.
In questo protocollo, l'estere succinimidilico H2DCFDA viene utilizzato per misurare gli eventi ossidativi all'interno del macropinosoma. Questa è una forma modificata di fluoresceina (2',7'-dicloroidoidrofluoresceina diacetato), che è minimamente fluorescente nella sua forma ridotta. Dopo l'ossidazione, la sua emissione di fluorescenza aumenta in modo significativo. Vale tuttavia la pena notare un avvertimento significativo di H2DCFDA - poiché si basa sulla fluorofora fluoresceina, la sua fluorescenza è anche spenta in compartimenti acidi e bisogna fare attenzione a controllare questa variabile quando si progettano esperimenti28. Simile all'approccio per la misurazione del pH, l'estere succinimidilico H2DCFDA sarà fissato covalentemente a 70 kDa destrano e il destrano da 70 kDa con etichetta TMR sarà usato come fluoroforo di riferimento (Figura 3A).
L'ovalbumina fluorescente sarà utilizzata per misurare la degradazione delle proteine all'interno dei macropinosomi. L'ovalbumina utilizzata qui è densamente etichettata con un colorante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL auto-spento. Dopo la digestione, i peptidi fortemente fluorescenti etichettati con coloranti vengono liberati. Poiché l'ovoalbumina non può essere facilmente coniugata a 70 kDa destrano, le cellule con destrano da 70 kDa e ovalbumina in fase fluida etichettati con TMR saranno co-incubate. Il segnale TMR verrà utilizzato per generare una maschera macropinosomica durante l'analisi post-imaging e il segnale liberato dall'ovoalbumina digerita sarà misurato all'interno della maschera (Figura 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

Negli ultimi anni, il campo della macropinocitosi è cresciuto rapidamente. La macropinocitosi è emersa come un meccanismo centrale attraverso il quale le cellule immunitarie innate mantengono l'omeostasi e l'immunità dell'organismo. Allo stesso tempo, e in contrasto con il suo ruolo omeostatico, può anche guidare varie patologie, tra cui il cancro e le infezioni virali. A differenza di altre modalità di endocitosi, gli strumenti sviluppati per studiare la maturazione dei macropinosomi rimangono sottosviluppati. Qui il protocollo descrive gli strumenti di nuova concezione per studiare l'ambiente redox all'interno del lume dei macropinosomi precoci e in maturazione. Vengono descritte le metodologie per l'utilizzo della microscopia a fluorescenza ratiometrica nella valutazione del pH, della produzione di specie reattive dell'ossigeno e della capacità degradativa all'interno del lume dei singoli macropinosomi nelle cellule vive. Le misurazioni di singoli organelli offrono il vantaggio di rivelare l'eterogeneità spaziotemporale, che spesso viene persa con approcci basati sulla popolazione. L'accento è posto sui principi di base della microscopia a doppio fluoroforo, tra cui la selezione della sonda, la strumentazione, la calibrazione e i metodi a singola cellula rispetto a quelli basati sulla popolazione.

Quando si misura il pH dei macropinosomi, c'è un periodo di tempo per il quale la dinamica dell'acidificazione non può essere misurata. Questo periodo corrisponde alla fase di carico destro (riquadro grigio in Figura 2C e Figura 3C,D)e varierà a seconda del tipo di cella utilizzata. La durata della fase di carico varierà con (i) l'attività macropinocitica delle cellule e (ii) la sensibilità dello strumento utilizzato. Si raccomanda di rego...

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Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Questo protocollo consente la valutazione in tempo reale di vari processi e parametri biochimici all'interno del lume dei singoli macropinosomi. Questi metodi possono essere impiegati per la scoperta di farmaci nella biologia cellulare della macropinocitosi. Questo protocollo offre il vantaggio di rivelare l'eterogeneità sia a livello cellulare che a livello di organelli.Un giorno prima del test semina raw264.7 cellule ad una densità di cinque volte 10 alla potenza delle cellule in 100 microlitri per pozzetto, in una piastra di fondo di vetro a 96 pozzetti con lati neri. Il giorno del test verificare se i pozzi sono confluenti almeno al 70%. Quindi lavare tutti i pozzi con 100 microlitri di HBSS, preriscaldati a 37 gradi Celsius.Quindi, aggiungere 100 microlitri di HBSS contenenti 0,025 milligrammi per millilitro di TMR etichettati 70 kilodalton destrano e 0,025 milligrammi per millilitro di fluoresceina etichettati 70 kilodalton destrano in ciascun pozzo, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatore e lavare le cellule sei volte con 100 microlitri di HBSS. Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 100 microlitri di HBSS preriscaldato alle cellule, quindi posizionare la piastra su un microscopio con uno stadio e una camera riscaldati.Dopo aver regolato i parametri di eccitazione ed emissione per TMR e fluoresceina secondo necessità, acquisire un'immagine da ciascun pozzo alternando tra i due fluorofori tra ciascun pozzo. Dopo la prima acquisizione, verificare se tutti i pozzi sono rimasti a fuoco su tutta la piastra, quindi acquisire le immagini di ciascun pozzo a intervalli da uno a 15 minuti per il periodo di tempo desiderato. Durante l'acquisizione dell'immagine, regolare il pH di un'aliquota di 50 millilitri di una soluzione ricca di potassio tamponata con HEPES da 25 millimolari a 7,5 utilizzando 10 molari cloridrico o 10 molari idrossido di potassio secondo necessità.Quindi regolare il pH di aliquote di 350 millilitri della soluzione ricca di potassio tamponata con MES da 25 millimolari a pH 6,5, pH 5,5 e pH 5,0. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, rimuovere l'HBSS dalla piastra a 96 pozzi contenente le cellule e aggiungere la soluzione ricca di potassio a pH 7,5. Quindi aggiungere Nigericina ad una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.Posizionare la piastra sul microscopio e acquisire le immagini di ciascun pozzo utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione dimostrate in precedenza. Per misurare gli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi, seminare le cellule RAW264.7 in una piastra a 96 pozzetti un giorno prima del test, come dimostrato in precedenza. Quindi il giorno del test lavare tutti i pozzi con 100 microlitri di HBSS preriscaldati a 37 gradi Celsius.Quindi, aggiungere 100 microlitri di HBSS contenenti 0,025 milligrammi per millilitro di TMR etichettati 70 kilodalton destrano e 0,025 milligrammi per millilitro di H2DCFDA etichettati 70 kilodalton destro a ciascun pozzo, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, lavare le celle sei volte con 100 microlitri di HBSS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di HBSS a ciascun pozzo e posizionare la piastra sul microscopio.Dopo aver regolato i parametri di eccitazione ed emissione per TMR e H2DCFDA secondo necessità, acquisire le immagini di ciascun pozzo a intervalli da uno a 15 minuti, come dimostrato in precedenza. Per misurare la digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi, seminare le cellule RAW264.7 un giorno prima del test, come dimostrato in precedenza. Quindi il giorno del test lavare tutti i pozzi con 100 microlitri di HBSS preriscaldati a 37 gradi Celsius.Successivamente aggiungere 100 microlitri di HBSS contenenti 0,025 milligrammi per millilitro di TMR etichettati 70 kilodalton destrano in 0,2 milligrammi per millilitro BODIPY etichettato ovalbumina a ciascun pozzo. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver rimosso le cellule dall'incubatrice, lavarle sei volte con 100 microlitri di HBSS.Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 100 microlitri di HBSS a ciascun pozzo, quindi posizionare la piastra sul microscopio. Dopo aver regolato i parametri di eccitazione ed emissione per TMR e BODIPY secondo necessità, acquisire immagini di ciascun pozzo a intervalli da uno a 15 minuti, come dimostrato in precedenza. Quando si misura il pH, gli eventi ossidativi o la degradazione proteica nei macropinosomi, la dinamica dell'acidificazione non può essere misurata per un certo periodo di tempo corrispondente alla fase di carico destro, che varia a seconda del tipo di cellula utilizzata.Quando si misura il pH del macropinosoma, il rapporto fluoresceina/TMR diventerà progressivamente più piccolo e si stabilizzerà entro i 15 minuti dall'acquisizione. Questo plateau corrisponde a un pH di circa cinque, che corrisponde approssimativamente al pH dei lisosomi. Al termine di ogni acquisizione, viene eseguita una calibrazione in situ.Il rapporto fluoresceina/TMR dovrebbe essere maggiore all'interno del tampone di taratura a pH 7,5 e diventare progressivamente più piccolo man mano che i tamponi di taratura diventano più acidi. Ciò consente la generazione di una curva di calibrazione. Quando si misurano gli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi, il rapporto tra H2DCFDA e TMR diventerà progressivamente più grande e probabilmente si stabilizzerà entro i primi 20-30 minuti in una raw264.7 attivata.Quando si misura la digestione delle proteine macropinosomiali, un segnale di fluoresceina progressivamente forte verrà liberato mentre l'ovalbumina viene digerita. Nelle cellule RAW264.7, l'aumento della fluorescenza liberata dall'ovalbumina etichettata BODIPY digerito, si stabilizzerà entro i primi 30 minuti. Con questo ruolo emergente nell'omeostasi e la sua rilevanza appena scoperta per la patologia del cancro, è attualmente in corso una ricerca sulla macropinocitosi rinascimentale.Questi metodi hanno fornito una cassetta degli attrezzi per esplorare il contributo della macropinocitosi a questi campi di studio.

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