Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Vi takker Universitetet i Calgary for støtten. Vi vil også takke Dr. Robin Yates for tilgang til reagenser, utstyr og nyttige diskusjoner.

1. Forberedelse av celler
<ol><li>Vokse Raw264.7 celler ved 37 °C og 5% CO2 til 70% samløp i RPMI supplert med 10% varmeinaktivert serum.</li>
	<li>En dag før analysen frø rå264,7 celler med en tetthet på 5 x 104 celler per brønn i en 96-brønns plate. Sørg for at hver brønn inneholder 100 μL vekstmedium. Sørg for at 96-brønnsplaten har svarte sider og en glassbunn for avbildning. MERK: Her ble 96-brønnsplater brukt til avbildning. 96-brønnsplatene tillater bruk av mindre mengder ...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

Selv om det finnes en rekke protokoller for både lave og høye gjennomstrømningsmålinger av makropinocytisk opptak i makrofager, fibroblaster og til og med Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, svært få forsøk er gjort for å måle lysbiokjemien til disse dynamiske rommene. Dette skyldes sannsynligvis en paucity av sonder som effektivt kan målrettes...

Makropinocytose refererer til opptaket av store mengder ekstracellulær væske i membranbundne cytoplasmiske organeller kalt makropinosomer1,2. Det er en svært bevart prosess utført av frittlevende encellede organismer, for eksempel amoeba Dictyostelium spp. 3, samt anthozoans4 og metazoans2. I de fleste celler er makropinocytose en indusert hendelse. Ligasjonen av celleoverflatereseptorer induserer fremspringet av aktindrevne plasmamembranforlengelser referert til som ruffles. En brøkdel av disse ruffles, av noen dårlig forstått mekanisme, forsegle på sine distale tips for å danne makropinosomer (men utover omfanget av dette metodepapiret, for detaljerte vurderinger av makropinocytosemekanikken, vennligst se referanse1,2,5,6,7). Den ekstracellulære stimulansen som induserer makropinocytose er oftest en løselig vekstfaktor5,8. Følgelig tillater den makropinocytiske hendelsen inntak av en bolus av ekstracellulært materiale som cellen kan utlede nyttige metabolitter for å lette veksten. Dessverre kan denne veien for næringslevering også drive patologi. Visse kreftceller har mutasjoner som resulterer i kontinuerlig eller konstituerende makropinocytose. Kontinuerlig levering av næringsstoffer letter ukontrollert spredning av kreftceller og har vært knyttet til spesielt aggressive svulster9,10,11,12,13. På samme måte kan virus indusere makropinocytose for å få tilgang til vertsceller, og dermed drive viral patologi14.
Macropinocytose fungerer også i vedlikehold av immunitet mot patogener. Visse medfødte immunceller som makrofager og dendrittiske celler engasjerer seg i konstituerende og aggressiv prøvetaking av ekstracellulær væske via makropinocytose6,15,16. Denne modusen for makropinocytose er utrolig aktiv, og en enkelt dendrittisk celle kan engorge seg med et volum ekstracellulær væske som tilsvarer sin egen vekt hver time17. Til tross for denne konstituerende prøvetakingen, replikerer ikke makrofager og dendrittiske celler ukontrollert som tumorceller, i stedet ser de ut til å behandle det ekstracellulære materialet på en slik måte at informasjon kan trekkes ut for å informere om tilstedeværelsen, eller faktisk fravær, av potensielle trusler. Informasjon ekstraheres som i) patogen-assosierte molekylære mønstre som kan leses av intracellulære patogengjenkjenningsreseptorer og ii) korte strekninger av aminosyrer som kan lastes på store histokompatibilitetsmolekyler for screening av celler i det adaptive immunsystemet16,18,19. Hvorvidt patogener undergraver denne banen for informasjonsbehandling av immunceller er for tiden uklart.
Til tross for disse veldefinerte og kritiske rollene for makropinocytose i både vedlikehold av immunitet og homeostase og i motsetning til andre mer ofte studerte moduser for endokytose, er lite av de indre (luminale) arbeidene til makropinosomer kjent. Å utvikle standardiserte protokoller og verktøy for å studere makropinosomenes lysende biokjemi vil ikke bare hjelpe oss med å forstå deres unike biologi bedre, men vil gi innsikt som kan utnyttes for nye terapeutiske strategier, inkludert legemiddellevering20. Dette metodemanuskriptet vil fokusere på nylig utviklede verktøy for å dissekere, på enkelt organellnivå, ulike aspekter av lysende biokjemi av makropinosomer.
Fluoroforer kan brukes til å måle spesifikke biokjemier av organeller hvis i) de partisjonerer fortrinnsvis inn i rommet av interesse og / eller ii) de gjennomgår spektralendringer som svar på interesseparameteren. For eksempel, når det gjelder pH, akkumuleres fluorescerende svake baser, som acridine oransje, cresylfiolett og LysoTracker-fargestoffer fortrinnsvis i sure organeller. Derfor er deres relative intensitet en grov indikasjon på at den merkede organellen er sur. Andre pH-responsive fluoroforer, som fluorescein, pHrodo og cypHer5e, gjennomgår spektralendringer ved binding til protoner (Figur 1A-C). Endringer i fluorescensutslippet av pH-sensitive fluoroforer kan derfor gi en nyttig tilnærming av pH. Bruken av enkle fluoroforer presenterer imidlertid en rekke ulemper. For eksempel kan endringer i fokusplanet, fotobleaching og endringer i volumet av individuelle organeller, en vanlig forekomst i makropinosomer21, indusere endringer i fluorescensintensiteten til enkle fluoroforer, og dette kan ikke lett korrigeres for22. Enkeltbølgelengdevurderinger, selv om de er nyttige for visualisering av sure rom, er derfor rent kvalitative.
En mer kvantitativ tilnærming er å målrette den parameterfølsomme fluoroforen sammen med en referansefluoreor til organell av interesse. Referansen fluorofor er ideelt ufølsom for biokjemiske endringer i organellen (Figur 1D-F) og kan derfor brukes til å korrigere for endringer i fokusplanet, organellarvolumet og til en viss grad fotobleking23. Ved hjelp av denne tilnærmingen, referert til som dual-fluorophore ratiometric fluorescence, kan korreksjon oppnås ved å generere et forhold mellom fluorescensutslippet av den parameterfølsomme fluoroforen til referansefluorefoforen.
Her vil protokollen bruke prinsippet om dual-fluorophore ratiometric imaging for å måle pH, oksidative hendelser og proteinforringelse innen makropinosomer. I hvert tilfelle vil en fluorofor bli valgt som er følsom for interesseparameteren og en referansefluorefor. For å målrette fluoroforene spesielt mot makropinosomer, vil de bli kovalent koblet til 70 kDa dextran, som fortrinnsvis er innlemmet i makropinosomer24. Alle analyser vil bli utført i Raw264.7 celler, men kan tilpasses andre celletyper. Der det er mulig, vil fluorescensforholdene kalibreres mot en referansekurve for å få absolutte verdier. Det er viktig at alle målinger utføres i levende celler for dynamisk og kvantitativ vurdering av lysstyrkemiljøet til makropinosomer.
Ved valg av pH-sensitive fluoroforer må en rekke hensyn veies. Den første er pKa av fluoroforen, som indikerer rekkevidden av pH-verdier der sonden vil være mest følsom. Hvis det antas at kort tid etter dannelsen vil makropinosomets pH være nær det ekstracellulære mediet (~ pH 7.2), og at det gradvis vil surne gjennom interaksjoner med sene endosomer og lysosomer (~ pH 5.0), bør en sonde med en pKa som er følsom innenfor dette området (Figur 2C) velges. Fluoroforfluorecein, som har en pKa på 6,4, er optimalt følsom innenfor det området. Det har blitt brukt mye for å måle andre lignende organeller, som fagosomer, og vil være den valgte fluoroforen i dette manuskriptet22,25. Som referanse fluorofor vil tetrametylrhodamin bli brukt, noe som er ufølsomt for pH (Figur 1E). Andre fluoroforer, som pHrodo og cypHer5e, kan erstattes av fluorescein der spektralegenskapene til fluorescein samsvarer med andre eksperimentelle variabler. Noen foreslåtte referansefluoreforer for pHrodo og cypHer5e er vist i figur 1.
En annen vurdering er metoden der de to fluoroforene vil bli målrettet spesielt mot makropinosomer. Dextran av størrelsen 70 kDa, som har en hydrodynamisk radius på omtrent 7 nm, holder seg ikke spesielt til celler og er innlemmet i makropinosomer, men ikke klarrinbelagte groper eller caveolae, og markerer derfor makropinosomer (Figur 2A og Figur 3A, B)16,24,26. I denne protokollen vil fluorescein-merket 70 kDa dextran og tetrametylrhodamin (TMR)-merket 70 kDa dextran bli brukt som henholdsvis pH-sensitive og referansesonder.
I medfødte immunceller representerer makropinocytose og fagocytose de to store rutene for internalisering av eksogent materiale for behandling og etterfølgende presentasjon til celler i adaptiv immunrespons27. Den forsiktige og koordinerte kontrollen av redokskjemien til lumen av fagosomer og makropinosomer er avgjørende for kontekstspesifikk behandling av eksogent materiale. Kanskje den mest studerte regulatoren av oksidative hendelser i fagosomer er NADPH oksidase, et stort multi-subenhetskompleks som produserer store mengder reaktive oksygenarter (ROS) innen lumen av fagosomer28. Faktisk er aktiviteten sentral for passende antigenbehandling innen fagosomer29,30. Likevel har aktiviteten til NADPH-oksidasen på makropinosomale membraner ikke blitt utforsket.
I denne protokollen brukes H2DCFDA succinimidyl ester til måling av oksidative hendelser i makropinosomet. Dette er en modifisert form for fluorescein (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate), som er minimalt fluoresccent i sin reduserte form. Ved oksidasjon øker fluorescensutslippet betydelig. Det er imidlertid verdt å merke seg en betydelig advarsel om H2DCFDA - som det er basert på fluorofor fluorescein, er fluorescensen også slokket i sure rom, og det må tas hensyn til å kontrollere for denne variabelen når du designer eksperimenter28. I likhet med tilnærmingen for måling av pH, vil H2DCFDA succinimidylsteren festes kovalent til 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran vil bli brukt som referansefluorefofor (figur 3A).
Fluorescerende ovalbumin vil bli brukt til å måle proteinforringelse innen makropinosomer. Ovalbumin som brukes her er tett merket med en 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL fargestoff som er selvslukket. Ved fordøyelsen frigjøres sterkt fluorescerende fargestoffmerkede peptider. Siden ovalbumin ikke lett kan konjugeres til 70 kDa dextran, vil celler med TMR-merket 70 kDa dextran og væskefase ovalbumin bli co-inkubert. TMR-signalet vil bli brukt til å generere en makropinosommaske under postavbildningsanalyse, og signalet frigjort fra det fordøyde ovalbuminet måles i masken (Figur 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

I de senere år har feltet makropinocytose vokst raskt. Makropinocytose har dukket opp som en sentral mekanisme der medfødte immunceller opprettholder organismal homeostase og immunitet. Samtidig, og i motsetning til sin homeostatiske rolle, kan den også drive ulike patologier, inkludert kreft og virusinfeksjoner. I motsetning til andre moduser for endokytose forblir verktøyene utviklet for å studere modning av makropinosomer underutviklet. Her beskriver protokollen nyutviklede verktøy for å studere redoksmiljøet i lumen av tidlige og modne makropinosomer. Metoder for bruk av ratiometrisk fluorescensmikroskopi i vurderingen av pH, produksjon av reaktive oksygenarter og nedbrytningskapasiteten i lumen av individuelle makropinosomer i levende celler er beskrevet. Enkle organelle målinger gir fordelen av å avsløre romlig heterogenitet, som ofte går tapt med befolkningsbaserte tilnærminger. Det legges vekt på de grunnleggende prinsippene for dobbel fluoroforeringsmålingsmikroskopi, inkludert sondevalg, instrumentering, kalibrering og encellede versus populasjonsbaserte metoder.

Ved måling av makropinosom pH er det en periode hvor dynamikken i forsuring ikke kan måles. Denne perioden tilsvarer dekstran innlastingsfasen (grå boks i figur 2C og figur 3C,D) og vil variere avhengig av celletypen som brukes. Lengden på lastefasen vil variere med (i) cellenes makropinocytiske aktivitet og (ii) følsomheten til instrumentet som brukes. Det anbefales å justere denne perioden ved starten av hvert eksperiment slik at et sign...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Vi beskriver protokoller for måling av pH, oksidative hendelser og proteinfordøyelse i individuelle makropinosomer i levende celler. Det legges vekt på metrisk mikroskopi med dobbel fluorofor og fordelene ved populasjonsbaserte teknikker.

Måling av pH, redokskjemier og nedbrytende kapasitet for makropinosomer ved hjelp av dual-fluorofor ratiometrisk mikroskopi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Denne protokollen tillater sanntidsvurdering av ulike prosesser og biokjemiske parametere innen lumen av individuelle makropinosomer. Disse metodene kan brukes til legemiddeloppdagelse i cellebiologien til makropinocytose. Denne protokollen gir fordelen av å avsløre heterogenitet på både cellulært og organellnivå.En dag før analysen frø Raw264.7 celler med en tetthet på fem ganger 10 til kraften av cellene i 100 mikroliter per brønn, i en glassbunn 96-brønns plate med svarte sider. På analysedagen må du kontrollere om brønnene er minst 70 % sammenfallende. Vask deretter alle brønnene med 100 mikroliter HBSS, forvarsel ved 37 grader Celsius.Deretter legger du til 100 mikroliter HBSS som inneholder 0,025 milligram per milliliter TMR merket 70 kilodalton dextran og 0,025 milligram per milliliter fluorescein merket 70 kilodalton dextran i hver brønn, og inkuber deretter cellene ved 37 Celsius grader i 15 minutter. Etter at inkubasjonen er fullført, fjern platen fra inkubatoren og vask cellene seks ganger med 100 mikroliter HBSS. Etter siste vask tilsett 100 mikroliter prewarmed HBSS til cellene og plasser deretter platen på et mikroskop med oppvarmet stadium og kammer.Etter å ha justert eksitasjons- og utslippsparametrene for TMR og fluorescein etter behov, må du skaffe et bilde fra hver brønn som veksler mellom de to fluoroforene mellom hver brønn. Etter det første oppkjøpet må du kontrollere om alle brønnene forble i fokus over hele platen, og deretter skaffe bilder av hver brønn med ett til 15 minutters intervaller i ønsket tidsperiode. Under bildeanskaffelsen justerer du pH for en 50 milliliter aliquot av en kaliumrik løsning bufret med 25 millimolar HEPES til 7,5 ved hjelp av 10 molar saltsyre, eller 10 molar kaliumhydroksid etter behov.Juster deretter pH på 350 milliliter aliquots av den kaliumrike løsningen bufret med 25 millimolar MES til pH 6,5, pH 5,5 og pH 5,0. Når bildeanskaffelsen er fullført, fjerner du HBSS fra 96-brønnsplaten som inneholder cellene, og tilsett den kaliumrike løsningen på pH 7.5. Tilsett deretter Nigericin ved en endelig konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter.Plasser platen tilbake på mikroskopet og skaff bilder av hver brønn ved hjelp av de samme anskaffelsesinnstillingene som vist tidligere. For å måle oksidative hendelser i makropinosomer, frø RAW264.7 celler i en 96-brønns plate en dag før analysen som vist tidligere. Deretter vasker du alle brønnene med 100 mikroliter HBSS på dagen for analysen til 37 grader Celsius.Deretter legger du til 100 mikroliter HBSS som inneholder 0,025 milligram per milliliter TMR merket 70 kilodalton dextran og 0,025 milligram per milliliter H2DCFDA merket 70 kilodalton dextran til hver brønn, og inkuber deretter cellene ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Etter å ha fjernet platen fra inkubatoren, vask cellene seks ganger med 100 mikroliter HBSS. Etter den siste vasken, tilsett 100 mikroliter HBSS til hver brønn og legg platen på mikroskopet.Etter å ha justert eksitasjons- og utslippsparametrene for TMR og H2DCFDA etter behov, må du skaffe bilder av hver brønn med ett til 15 minutters intervaller som vist tidligere. For å måle protein fordøyelse i makropinosomer, frø RAW264.7 celler en dag før analysen, som vist tidligere. Deretter vasker du alle brønnene med 100 mikroliter HBSS på dagen for analysen ved 37 grader Celsius.Deretter legger du til 100 mikroliter HBSS som inneholder 0,025 milligram per milliliter TMR merket 70 kilodalton dextran i 0,2 milligram per milliliter BODIPY merket ovalbumin til hver brønn. Inkuber deretter platen ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Etter å ha fjernet cellene fra inkubatoren, vask dem seks ganger med 100 mikroliter HBSS.Etter siste vask tilsett 100 mikroliter HBSS til hver brønn, og plasser deretter platen på mikroskopet. Etter å ha justert eksitasjons- og utslippsparametrene for TMR og BODIPY etter behov, må du skaffe bilder av hver brønn med ett til 15 minutters intervaller som vist tidligere. Ved måling av pH, oksidative hendelser eller proteinforringelse i makropinosomer kan ikke forsuringsdynamikken måles i en viss tidsperiode som tilsvarer dekstranbelastningsfasen, som varierer avhengig av celletypen som brukes.Ved måling av makropinosom pH vil fluorescein- til TMR-forholdet bli gradvis mindre og vil platå innen 15 minutter etter oppkjøpet. Dette platået tilsvarer en pH på omtrent fem, som omtrent samsvarer med pH av lysosomer. På slutten av hvert oppkjøp utføres en In situ-kalibrering.Fluorescein- til TMR-forholdet bør være størst innenfor kalibreringsbufferen ved pH 7.5 og bli gradvis mindre etter hvert som kalibreringsbufferne blir surere. Dette gjør det mulig å bruke en kalibreringskurve. Ved måling av oksidative hendelser i makropinosomer vil forholdet mellom H2DCFDA og TMR bli gradvis større og sannsynligvis platå i løpet av de første 20 til 30 minuttene i en aktivert RAW264.7 celler.Ved måling av makropinosomal protein fordøyelse, vil et gradvis sterkt fluoresceinsignal frigjøres når ovalbumin fordøyes. I RAW264.7 celler vil økningen i fluorescens frigjort fra den fordøyde BODIPY merket ovalbumin, platå i løpet av de første 30 minuttene. Med denne nye rollen i homeostase og det er nylig oppdaget relevans for kreftpatologi, er en renessanse makropinocytoseforskning for tiden i gang.Disse metodene gitt til en verktøykasse for å utforske bidraget av makropinocytose til disse studiefeltene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Måle Lokale anafylaksi i Mus

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokasjon i vertsceller Bruke Beta-laktamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Måling fysiologiske responser av<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensoriske nevroner til Lipid Pheromones Bruke levende Kalsium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH ​​i Dental Biofilm

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Bildebehandling nøytrofile fagosomet og Cytoplasm Ved hjelp av en Proporsjonellekspansjon pH-indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...