Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Agradecemos à Universidade de Calgary pelo apoio. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Robin Yates pelo acesso a reagentes, equipamentos e discussões úteis.

1. Preparação de células
<ol><li>Cultivar células Raw264.7 a 37 °C e 5% de CO2 a 70% de confluência em RPMI suplementado com soro inativado por calor de 10%.</li>
	<li>Um dia antes do ensaio, as células raw264.7 com uma densidade de 5 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços. Certifique-se de que cada poço contém 100 μL de meio de crescimento. Certifique-se de que a placa de 96 poços tenha lados pretos e um fundo de vidro para imagem. NOTA: Aqui, foram utilizadas placas de ...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

Embora existam uma série de protocolos para medidas de baixo e alto rendimento de absorção macropinóctica em macrófagos, fibroblastos e até mesmo dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, muito poucas tentativas foram feitas para medir a bioquímica luminal desses compartimentos dinâmicos. Isso é provavelmente devido a uma escassez de sondas que podem ...

Macropinocistose refere-se à absorção de grandes quantidades de fluido extracelular em organelas citoplasmáticas ligadas à membrana chamadas macropinossomos1,2. É um processo altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida livre, como a ameba Dictyostelium spp. 3, assim como anthozoans4 e metazoanos2. Na maioria das células, a macropinocitose é um evento induzido. A ligadura dos receptores de superfície celular induz a saliência de extensões de membrana plasmática movidas por actina, referidas como babados. Uma fração desses babados, por algum mecanismo mal compreendido, sela em suas pontas distais para formar macropinossomos (embora além do escopo deste artigo de métodos, para revisões detalhadas sobre a mecânica da macropinocitose, consulte as referências1,2,5,6,7). O estímulo extracelular que induz a macropinocitose é, na maioria dasvezes,um fator de crescimento solúvel5,8. Assim, o evento macropinocítico permite a ingestão de um bolus de material extracelular do qual a célula pode derivar metabólitos úteis para facilitar o crescimento. Infelizmente, esse caminho para o parto de nutrientes também pode impulsionar a patologia. Certas células cancerígenas abrigam mutações que resultam em macropinotose contínua ou constitutiva. A entrega contínua de nutrientes facilita a proliferação descontrolada de células cancerosas e tem sido associada a tumores particularmente agressivos9,10,11,12,13. Da mesma forma, os vírus podem induzir a macropinocitose a ter acesso às células hospedeiras, conduzindo assim a patologia viral14.
A macropinocistose também funciona na manutenção da imunidade aos patógenos. Certas células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas, envolvem-se na amostragem constitutiva e agressiva do fluido extracelular via macropinocistose6,15,16. Este modo de macropinocistose é incrivelmente ativo, e uma única célula dendrítica pode engorgar-se com um volume de fluido extracelular equivalente ao seu próprio peso a cada hora17. Apesar dessa amostragem constitutiva, macrófagos e células dendríticas não se replicam incontrolavelmente como as células tumorais, em vez disso, parecem processar o material extracelular de tal forma que as informações podem ser extraídas para informar sobre a presença, ou mesmo ausência, de ameaças potenciais. As informações são extraídas como i) padrões moleculares associados ao patógeno que podem ser lidos por receptores de reconhecimento de patógenos intracelulares e ii) pequenos trechos de aminoácidos que podem ser carregados em moléculas de histocompatibilidade principal para triagem por células do sistema imunológico adaptativo16,18,19. Não está claro se os patógenos subvertem esse caminho para o processamento de informações por células imunes.
Apesar desses papéis bem definidos e críticos para a macropinocistose tanto na manutenção da imunidade quanto na homeostase e em contraste com outros modos mais comumente estudados de endocitose, pouco dos trabalhos internos (luminosos) dos macropinossos são conhecidos. O desenvolvimento de protocolos e ferramentas padronizadas para estudar a bioquímica luminal dos macropinossos não só nos ajudará a entender melhor sua biologia única, mas fornecerá insights que podem ser aproveitados para novas estratégias terapêuticas, incluindo o fornecimento de medicamentos20. Este manuscrito metodu em ferramentas recentemente desenvolvidas para dissecar, no nível único da organela, vários aspectos da bioquímica luminal dos macropinossomos.
Fluoroforos podem ser usados para medir bioquímicas específicas de organelas se i) eles particionam preferencialmente no compartimento de interesse e/ou ii) sofrem alterações espectrais em resposta ao parâmetro de interesse. Por exemplo, no caso do pH, bases fracas fluorescentes, como laranja acridina, violeta cresyl, e os corantes LysoTracker se acumulam preferencialmente em organelas ácidas. Portanto, sua intensidade relativa é uma indicação aproximada de que a organela rotulada é ácida. Outros fluoroforos responsivos ao pH, como fluoresceína, pHrodo e cypHer5e, sofrem alterações espectrais ao se vincularem a prótons(Figura 1A-C). Alterações na emissão de fluorescência de fluoroforos sensíveis ao pH podem, portanto, fornecer uma aproximação útil do pH. O uso de fluoroforos únicos, no entanto, apresenta uma série de desvantagens. Por exemplo, alterações no plano focal, fotobleachamento e alterações no volume de organelas individuais, uma ocorrência comum em macropinosomos21,podem induzir alterações na intensidade de fluorescência de fluoroforos únicos, e isso não pode ser facilmente corrigido para22. As avaliações de comprimento de onda única, embora úteis para visualizar compartimentos ácidos, são, portanto, puramente qualitativas.
Uma abordagem mais quantitativa é atingir o fluoróforo sensível aos parâmetros, juntamente com um fluoróforo de referência à organela de interesse. O fluoróforo de referência é idealmente insensível às alterações bioquímicas dentro da organela (Figura 1D-F) e pode, portanto, ser usado para corrigir para alterações no plano focal, volume organellar e, em certa medida, fotobleaching23. Utilizando esta abordagem, referida como fluorescência multitorscência de fluorofora dupla, a correção pode ser alcançada gerando uma razão da emissão de fluorescência do fluorophore sensível aos parâmetros para o fluorophore de referência.
Aqui, o protocolo utilizará o princípio da imagem métrica de dupla fluorofora para medir pH, eventos oxidativos e degradação de proteínas dentro de macropinossos. Em cada caso, será selecionado um fluoróforo sensível ao parâmetro de interesse e a um fluoróforo de referência. Para direcionar os fluoroforos especificamente aos macropinossomos, eles serão covalentemente acoplados a 70 kDa dextran, que é preferencialmente incorporado em macropinossos24. Todos os ensaios serão realizados em células Raw264.7, mas podem ser adaptados a outros tipos de células. Sempre que possível, as razões de fluorescência serão calibradas em relação a uma curva de referência para ganhar valores absolutos. É importante ressaltar que todas as medições serão realizadas em células vivas para avaliação dinâmica e quantitativa do ambiente luminal dos macropinossomos.
Ao selecionar fluoroforos sensíveis ao pH, uma série de considerações devem ser ponderadas. O primeiro é o pKa do fluoróforo, que indica a faixa de valores de pH em que a sonda será mais sensível. Se for assumido que logo após a formação, o pH do macropinossomo estará próximo ao do meio extracelular (~pH 7.2) e que ele irá acidificar progressivamente através de interações com endósmos e lysosomos tardios (~pH 5.0), então uma sonda com um pKa sensível dentro dessa faixa(Figura 2C) deve ser selecionada. O fluoresceína fluorofora, que tem um pKa de 6.4, é otimizado dentro dessa faixa. Tem sido usado extensivamente para medir outras organelas semelhantes, como os faósmos, e será o fluoróforo de escolha neste manuscrito22,25. Como fluoróforo de referência, será utilizada a tetrametilrhodamina, que é insensível ao pH(Figura 1E). Outros fluoroforos, como pHrodo e cypHer5e podem ser substituídos por fluoresceína onde as propriedades espectrais da fluoresceína correspondem a outras variáveis experimentais. Alguns fluoroforos de referência sugeridos para pHrodo e cypHer5e são mostrados na Figura 1.
Uma segunda consideração é o método pelo qual os dois fluoroforos serão direcionados especificamente para macropinossomos. O Dextran do tamanho 70 kDa, que tem um raio hidrodinâmico de aproximadamente 7 nm, não gruda não especificamente nas células e é incorporado em macropinossos, mas não em poços revestidos de clathrin ou caveolae, e, portanto, marca macropinossos(Figura 2A e Figura 3A,B)16,24,26. Neste protocolo, o dextran de 70 kDa e tetramethylrhodamina (TMR) rotulados de 70 kDa dextran serão usados como sondas sensíveis ao pH e referência, respectivamente.
Nas células imunes inatas, macropinocistose e fagocitose representam as duas principais rotas para a internalização do material exógeno para processamento e posterior apresentação às células da resposta imune adaptativa27. O controle cuidadoso e coordenado da química redox do lúmen de fágoras e macropinossos é fundamental para o processamento específico do contexto do material exógeno. Talvez o regulador mais bem estudado de eventos oxidativos em fagosmos é o NADPH oxidase, um grande complexo multi-subunidade que produz grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (ROS) dentro do lúmen de fagosomes28. De fato, sua atividade é central para o processamento adequado de antígenos dentro dos fágoras29,30. No entanto, a atividade do NADPH oxidase em membranas macropinosômicas não foi explorada.
Neste protocolo, o éster de succinimidyl H2DCFDA é usado para medir eventos oxidativos dentro do macropinosome. Esta é uma forma modificada de fluoresceína (2',7'-diclorodihioresceto), que é minimamente fluorescente em sua forma reduzida. Após a oxidação, sua emissão de fluorescência aumenta significativamente. No entanto, vale a pena notar uma ressalva significativa do H2DCFDA - como é baseada na fluoresceína fluorofora, sua fluorescência também é saciada em compartimentos ácidos, e deve-se tomar cuidado para controlar essa variável ao projetar experimentos28. Semelhante à abordagem para medir o pH, o éster succinimidil H2DCFDA será covalentemente anexado ao dextran de 70 kDa e o dextran de 70 kDa com rótulo TMR será usado como fluoróforo de referência(Figura 3A).
Ovalbumina fluorescente será usada para medir a degradação da proteína dentro de macropinossomos. O ovalbumin usado aqui é densamente rotulado com um corante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) fl que é auto-extinto. Após a digestão, peptídeos fortemente fluorescentes com tinta são liberados. Como o ovalbumin não pode ser facilmente conjugado a dextran de 70 kDa, as células com dextran de 70 kDa com tmr e ovalbumina de fase fluida serão co-incubadas. O sinal TMR será usado para gerar uma máscara macropinosa durante a análise pós-imagem, e o sinal liberado da ovalbumina digerida será medido dentro da máscara(Figura 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

Nos últimos anos, o campo da macropinocitose cresceu rapidamente. A macropinocistose emergiu como um mecanismo central pelo qual as células imunes inatas mantêm a homeostase e a imunidade do organismo. Simultaneamente, e ao contrário de seu papel homeostático, também pode conduzir várias patologias, incluindo câncer e infecções virais. Ao contrário de outros modos de endocitose, as ferramentas desenvolvidas para estudar a maturação de macropinossomos permanecem subdesenvolvidas. Aqui o protocolo descreve ferramentas recém-desenvolvidas para estudar o ambiente redox dentro do lúmen de macropinosos precoces e maduros. Metodologias para o uso de microscopia de fluorescência métrica ratiorada na avaliação do pH, produção de espécies reativas de oxigênio e a capacidade degradante dentro do lúmen de macropinosos individuais em células vivas são descritas. Medidas únicas de organela oferecem a vantagem de revelar a heterogeneidade espacial, que muitas vezes se perde com abordagens de base populacional. A ênfase é colocada nos princípios básicos da microscopia multiscopia multiscopia multiscopia fluoroforatométrica, incluindo seleção de sondas, instrumentação, calibração e métodos unicelulares versus populações.

Ao medir o pH macropinosome, há um período de tempo para o qual a dinâmica da acidificação não pode ser medida. Este período corresponde à fase de carregamento do dextran (caixa cinza na Figura 2C e Figura 3C,D) e variará dependendo do tipo de célula utilizada. O comprimento da fase de carregamento varia-se com (i) a atividade macropinocítica das células e (ii) a sensibilidade do instrumento utilizado. Recomenda-se ajustar este perí...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Descrevemos protocolos para medir pH, eventos oxidativos e digestão de proteínas em macropinosos individuais em células vivas. Uma ênfase é colocada na microscopia metométrica de dupla fluorofora e nas vantagens que oferece sobre técnicas de base populacional.

Medindo o pH, As Químicas Redox e a Capacidade Degradativa dos Macropinossos usando microscopia multiscopia memétrica de proporção de fluorofora dupla

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Este protocolo permite a avaliação em tempo real de vários processos e parâmetros bioquímicos dentro do lúmen de macropinossos individuais. Esses métodos podem ser empregados para a descoberta de drogas na biologia celular da macropinocise. Este protocolo oferece a vantagem de revelar a heterogeneidade tanto no nível celular quanto na organela.Um dia antes do ensaio semente Raw264.7 células a uma densidade de cinco vezes 10 para o poder das células em 100 microliters por poço, em uma placa de fundo de vidro 96-bem com lados pretos. No dia do ensaio verifique se os poços são pelo menos 70% confluentes. Em seguida, lave todos os poços com 100 microliters de HBSS, pré-armados a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione 100 microliters de HBSS contendo 0,025 miligramas por mililitro de TMR rotulados 70 kilodalton dextran e 0,025 miligramas por mililitro de fluoresceína rotulado 70 kilodalton dextran em cada poço, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da incubação, remova a placa da incubadora e lave as células seis vezes com 100 microliters de HBSS. Após a última lavagem adicione 100 microlitros de HBSS pré-armados às células e, em seguida, coloque a placa em um microscópio com um palco e câmara aquecidos.Após ajustar os parâmetros de excitação e emissão para TMR e fluoresceína conforme necessário, adquira uma imagem de cada poço alternando entre os dois fluoroforos entre cada poço. Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permaneceram em foco em toda a placa, em seguida, adquirir imagens de cada poço em intervalos de um a 15 minutos para o tempo desejado. Durante a aquisição da imagem, ajuste o pH de uma alíquota de 50 mililitros de uma solução rica em potássio tamponada com HEPES de 25 milialares a 7,5 usando 10 ácido clorídrico molar, ou 10 hidróxido de potássio molar conforme necessário.Em seguida, ajuste o pH de 350 mililitros aliquots da solução rica em potássio tamponada com MES de 25 milimilhas para pH 6.5, pH 5.5 e pH 5.0. Uma vez concluída a aquisição da imagem, remova o HBSS da placa de 96 poços contendo as células e adicione a solução rica em potássio em pH 7.5. Em seguida, adicione nígericina em uma concentração final de 10 microgramas por mililitro.Coloque a placa de volta no microscópio e adquira imagens de cada poço usando as mesmas configurações de aquisição que demonstradas anteriormente. Para medir eventos oxidativos dentro de macropinossomos, as células RAW264.7 em uma placa de 96 poços um dia antes do ensaio, como demonstrado anteriormente. Em seguida, no dia do ensaio lavar todos os poços com 100 microliters de HBSS pré-armados a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione 100 microliters de HBSS contendo 0,025 miligramas por mililitro de TMR rotulados 70 kilodalton dextran e 0,025 miligramas por mililitro de H2DCFDA rotulados 70 kilodalton dextran para cada poço, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de remover a placa da incubadora, lave as células seis vezes com 100 microliters de HBSS. Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de HBSS a cada poço e coloque a placa no microscópio.Depois de ajustar os parâmetros de excitação e emissão para TMR e H2DCFDA conforme necessário, adquira imagens de cada poço em intervalos de um a 15 minutos, como demonstrado anteriormente. Para medir a digestão proteica dentro dos macropinossomos, as células raw264.7 sementes um dia antes do ensaio, como demonstrado anteriormente. Em seguida, no dia do ensaio lavar todos os poços com 100 microliters de HBSS pré-armados a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione 100 microliters de HBSS contendo 0,025 miligramas por mililitro de TMR rotulado 70 kilodalton dextran em 0,2 miligramas por mililitro BODIPY rotulado ovalbumin para cada poço. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de remover as células da incubadora, lave-as seis vezes com 100 microliters de HBSS.Após a última lavagem adicione 100 microlitros de HBSS a cada poço, em seguida, coloque a placa no microscópio. Depois de ajustar os parâmetros de excitação e emissão para TMR e BODIPY conforme necessário, adquira imagens de cada poço em intervalos de um a 15 minutos, como demonstrado anteriormente. Ao medir o pH, eventos oxidativos ou degradação proteica em macropinossomos, a dinâmica da acidificação não pode ser medida por um determinado período de tempo correspondente à fase de carregamento do dextran, que varia dependendo do tipo celular utilizado.Ao medir o pH macropinoso, a relação fluoresceína e TMR se tornará progressivamente menor e irá subir dentro dos 15 minutos de aquisição. Este platô corresponde a um pH de aproximadamente cinco, que corresponde aproximadamente ao pH de lysososomes. Ao final de cada aquisição, é realizada uma calibração In situ.A relação fluoresceína para TMR deve ser maior dentro do buffer de calibração no pH 7.5 e tornar-se progressivamente menor à medida que os buffers de calibração se tornam mais ácidos. Isso permite a geração de uma curva de calibração. Ao medir eventos oxidativos dentro de macropinossomos, a razão de H2DCFDA para TMR se tornará progressivamente maior e provavelmente irá subir nos primeiros 20 a 30 minutos em uma célula RAW264.7 ativada.Ao medir a digestão da proteína macropinosômica, um sinal de fluoresceína progressivamente forte será liberado à medida que o ovalbumina for digerido. Nas células RAW264.7, o aumento da fluorescência liberada da ovalbumina rotulada bodipy digerida, será platô nos primeiros 30 minutos. Com esse papel emergente na homeostase e sua relevância recém-descoberta para a patologia do câncer, uma pesquisa de macropinocose renascentista está em andamento.Esses métodos foram fornecidos a uma caixa de ferramentas para explorar a contribuição da macropinocitose para esses campos de estudo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Imunologia e Infecção

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Medindo respostas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imagem raciométrica de pH extracelular no biofilme dentário

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...