Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Agradecemos a la Universidad de Calgary por su apoyo. También nos gustaría agradecer al Dr. Robin Yates por el acceso a reactivos, equipos y discusiones útiles.

1. Preparación de las células
<ol><li>Cultive células Raw264.7 a 37 °C y 5% de CO2 a 70% de confluencia en RPMI suplementado con 10% de suero inactivado por calor.</li>
	<li>Un día antes del ensayo, semuela células Raw264.7 a una densidad de 5 x 104 células por pozo en una placa de 96 pozos. Asegúrese de que cada pozo contenga 100 μL de medio de crecimiento. Asegúrese de que la placa de 96 pozos tenga lados negros y un fondo de vidrio para obtener imágenes. NOTA: Aquí, se utilizaron...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

Aunque hay una serie de protocolos para mediciones de bajo y alto rendimiento de la captación macropinocítica en macrófagos, fibroblastos e incluso Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, muy pocos intentos se han hecho para medir la bioquímica luminal de estos compartimentos dinámicos. Esto probablemente se deba a una escasez de sondas que puedan dirig...

La macropinocitosis se refiere a la absorción de grandes cantidades de líquido extracelular en orgánulos citoplasmáticos unidos a la membrana llamados macropinosomas1,2. Es un proceso altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida libre, como la ameba Dictyostelium spp. 3, así como antozoos4 y metazoos2. En la mayoría de las células, la macropinocitosis es un evento inducido. La ligadura de los receptores de la superficie celular induce la protrusión de extensiones de membrana plasmática impulsadas por actina conocidas como volantes. Una fracción de esos volantes, por algún mecanismo poco conocido, se sellan en sus puntas distales para formar macropinosomas (aunque más allá del alcance de este documento de métodos, para revisiones detalladas sobre la mecánica de la macropinocitosis, consulte las referencias1,2,5,6,7). El estímulo extracelular que induce la macropinocitosis es más a menudo un factor de crecimiento soluble5,8. En consecuencia, el evento macropinocítico permite la ingestión de un bolo de material extracelular del cual la célula puede derivar metabolitos útiles para facilitar el crecimiento. Desafortunadamente, esta vía para la entrega de nutrientes también puede impulsar la patología. Ciertas células cancerosas albergan mutaciones que resultan en macropinocitosis continua o constitutiva. La entrega continua de nutrientes facilita la proliferación incontrolada de células cancerosas y se ha relacionado con tumores particularmente agresivos9,10,11,12,13. Del mismo modo, los virus pueden inducir macropinocitosis para obtener acceso a las células huésped, impulsando así la patología viral14.
La macropinocitosis también funciona en el mantenimiento de la inmunidad a los patógenos. Ciertas células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas participan en el muestreo constitutivo y agresivo de líquido extracelular a través de la macropinocitosis6,15,16. Este modo de macropinocitosis es increíblemente activo, y una sola célula dendrítica puede congestionarse con un volumen de líquido extracelular equivalente a su propio peso cada hora17. A pesar de este muestreo constitutivo, los macrófagos y las células dendríticas no se replican incontrolablemente como lo hacen las células tumorales, sino que parecen procesar el material extracelular de tal manera que se puede extraer información para informar sobre la presencia, o incluso ausencia, de amenazas potenciales. La información se extrae como i) patrones moleculares asociados a patógenos que pueden ser leídos por receptores de reconocimiento de patógenos intracelulares y ii) tramos cortos de aminoácidos que pueden cargarse en las principales moléculas de histocompatibilidad para su detección por células del sistema inmune adaptativo16,18,19. En la actualidad, no está claro si los patógenos subvierten esta vía para el procesamiento de la información por parte de las células inmunes.
A pesar de estos roles bien definidos y críticos para la macropinocitosis tanto en el mantenimiento de la inmunidad como en la homeostasis y en contraste con otros modos de endocitosis más comúnmente estudiados, se conoce poco del funcionamiento interno (luminal) de los macropinosomas. El desarrollo de protocolos y herramientas estandarizados para estudiar la bioquímica luminal de los macropinosomas no solo nos ayudará a comprender mejor su biología única, sino que también proporcionará información que se puede aprovechar para nuevas estrategias terapéuticas, incluida la administración de fármacos20. Este manuscrito del método se centrará en herramientas recientemente desarrolladas para diseccionar, a nivel de orgánulo único, varios aspectos de la bioquímica luminal de los macropinosomas.
Los fluoróforos se pueden utilizar para medir bioquímicas específicas de orgánulos si i) se dividen preferentemente en el compartimento de interés y/o ii) sufren cambios espectrales en respuesta al parámetro de interés. Por ejemplo, en el caso del pH, las bases débiles fluorescentes, como la naranja acridina, la violeta cresil y los colorantes LysoTracker se acumulan preferentemente en orgánulos ácidos. Por lo tanto, su intensidad relativa es una indicación aproximada de que el orgánulo etiquetado es ácido. Otros fluoróforos sensibles al pH, como la fluoresceína, pHrodo y cypHer5e, sufren cambios espectrales al unirse a protones(Figura 1A-C). Por lo tanto, los cambios en la emisión de fluorescencia de los fluoróforos sensibles al pH pueden proporcionar una aproximación útil del pH. El uso de fluoróforos individuales, sin embargo, presenta una serie de desventajas. Por ejemplo, los cambios en el plano focal, el fotobleaching y los cambios en el volumen de orgánulos individuales, una ocurrencia común en los macropinosomas21,pueden inducir cambios en la intensidad de fluorescencia de fluoróforos individuales, y esto no se puede corregir fácilmente para22. Las evaluaciones de longitud de onda única, aunque útiles para visualizar compartimentos ácidos, son, por lo tanto, puramente cualitativas.
Un enfoque más cuantitativo es apuntar al fluoróforo sensible a los parámetros junto con un fluoróforo de referencia al orgánulo de interés. El fluoróforo de referencia es idealmente insensible a los cambios bioquímicos dentro del orgánulo (Figura 1D-F) y, por lo tanto, se puede utilizar para corregir cambios en el plano focal, el volumen organelar y, hasta cierto punto, el fotobleaching23. Utilizando este enfoque, denominado fluorescencia ratiométrica de fluoróforo dual, se puede lograr la corrección generando una relación entre la emisión de fluorescencia del fluoróforo sensible a los parámetros y el fluoróforo de referencia.
Aquí, el protocolo utilizará el principio de imágenes ratiométricas de fluoróforo dual para medir el pH, los eventos oxidativos y la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. En cada caso, se seleccionará un fluoróforo que sea sensible al parámetro de interés y un fluoróforo de referencia. Para dirigir los fluoróforos específicamente a los macropinosomas, se acoplarán covalentemente al dextrano de 70 kDa, que se incorpora preferentemente a los macropinosomas24. Todos los ensayos se realizarán en células Raw264.7, pero se pueden adaptar a otros tipos de células. Siempre que sea posible, las relaciones de fluorescencia se calibrarán contra una curva de referencia para obtener valores absolutos. Es importante destacar que todas las mediciones se realizarán en células vivas para la evaluación dinámica y cuantitativa del entorno luminal de los macropinosomas.
Al seleccionar fluoróforos sensibles al pH, se deben sopesar una serie de consideraciones. El primero es el pKa del fluoróforo, que indica el rango de valores de pH en el que la sonda será más sensible. Si se asume que poco después de la formación, el pH del macropinosoma será cercano al del medio extracelular (~pH 7.2) y que se acidificará progresivamente a través de interacciones con endosomas tardíos y lisosomas (~pH 5.0), entonces se debe seleccionar una sonda con un pKa que sea sensible dentro de ese rango (Figura 2C). La fluoresceína fluorófora, que tiene un pKa de 6.4, es óptimamente sensible dentro de ese rango. Se ha utilizado ampliamente para medir otros orgánulos similares, como los fagosomas, y será el fluoróforo de elección en este manuscrito22,25. Como fluoróforo de referencia, se utilizará tetrametilrodiamina, que es insensible al pH(Figura 1E). Otros fluoróforos, como pHrodo y cypHer5e pueden ser sustituidos por fluoresceína donde las propiedades espectrales de la fluoresceína coinciden con otras variables experimentales. Algunos fluoróforos de referencia sugeridos para pHrodo y cypHer5e se muestran en la Figura 1.
Una segunda consideración es el método por el cual los dos fluoróforos se dirigirán específicamente a los macropinosomas. El dextrano del tamaño 70 kDa, que tiene un radio hidrodinámico de aproximadamente 7 nm, no se adhiere específicamente a las células y se incorpora a los macropinosomas, pero no a los hoyos recubiertos de clatrina o caveolas, y por lo tanto marca los macropinosomas(Figura 2A y Figura 3A,B)16,24,26. En este protocolo, se utilizarán dextrano de 70 kDa dextrano y tetrametilrodamina (TMR) de 70 kDa etiquetados con fluoresceína como sondas sensibles al pH y de referencia, respectivamente.
En las células inmunes innatas, la macropinocitosis y la fagocitosis representan las dos vías principales para la internalización del material exógeno para su procesamiento y posterior presentación a las células de la respuesta inmune adaptativa27. El control cuidadoso y coordinado de la química redox de la luz de los fagosomas y macropinosomas es fundamental para el procesamiento específico del contexto del material exógeno. Quizás el regulador más estudiado de los eventos oxidativos en los fagosomas es la NADPH oxidasa, un gran complejo multi-subunidad que produce grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz de los fagosomas28. De hecho, su actividad es fundamental para el procesamiento apropiado de antígenos dentro de los fagosomas29,30. Sin embargo, la actividad de la NADPH oxidasa en las membranas macropinosómicas no se ha explorado.
En este protocolo, el éster de succinimidil H2DCFDA se utiliza para medir eventos oxidativos dentro del macropinosoma. Esta es una forma modificada de fluoresceína (2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato), que es mínimamente fluorescente en su forma reducida. Tras la oxidación, su emisión de fluorescencia aumenta significativamente. Sin embargo, vale la pena señalar una advertencia significativa de H2DCFDA: ya que se basa en la fluoresceína fluoróforo, su fluorescencia también se apaga en compartimentos ácidos y se debe tener cuidado para controlar esta variable al diseñar experimentos28. Similar al enfoque para medir el pH, el éster de succinimidil H2DCFDA se unirá covalentemente al dextrano de 70 kDa y el dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR se utilizará como fluoróforo de referencia(Figura 3A).
La ovoalbúmina fluorescente se utilizará para medir la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. La ovoalbúmina utilizada aquí está densamente etiquetada con un tinte FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indáceno (BODIPY) que se autoexpresa. Tras la digestión, se liberan péptidos fuertemente fluorescentes etiquetados con colorantes. Como la ovoalbúmina no se puede conjugar fácilmente con 70 kDa dextrano, las células con dextrano de 70 kDa y ovoalbúmina en fase fluida se coincuban. La señal TMR se utilizará para generar una máscara de macropinosoma durante el análisis posterior a la obtención de imágenes, y la señal liberada de la ovoalbúmina digerida se medirá dentro de la máscara(Figura 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
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measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

En los últimos años, el campo de la macropinocitosis ha crecido rápidamente. La macropinocitosis ha surgido como un mecanismo central por el cual las células inmunes innatas mantienen la homeostasis y la inmunidad del organismo. Simultáneamente, y en contraste con su papel homeostático, también puede conducir a diversas patologías, incluyendo el cáncer y las infecciones virales. A diferencia de otros modos de endocitosis, las herramientas desarrolladas para estudiar la maduración de los macropinosomas permanecen subdesarrolladas. Aquí el protocolo describe herramientas recientemente desarrolladas para estudiar el entorno redox dentro de la luz de los macropinosomas tempranos y en maduración. Se describen metodologías para el uso de la microscopía de fluorescencia ratiométrica en la evaluación del pH, la producción de especies reactivas de oxígeno y la capacidad degradativa dentro de la luz de macropinosomas individuales en células vivas. Las mediciones de orgánulos individuales ofrecen la ventaja de revelar la heterogeneidad espaciotemporal, que a menudo se pierde con los enfoques basados en la población. Se hace hincapié en los principios básicos de la microscopía fluorófora dual, incluida la selección de sondas, la instrumentación, la calibración y los métodos de una sola célula frente a los basados en la población.

Al medir el pH del macropinosoma, hay un período de tiempo durante el cual no se puede medir la dinámica de la acidificación. Este período corresponde a la fase de carga de dextrano (cuadro gris en la Figura 2C y Figura 3C,D)y variará según el tipo de celda utilizada. La duración de la fase de carga variará con (i) la actividad macropinocítica de las células y (ii) la sensibilidad del instrumento utilizado. Se recomienda ajustar este p...

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Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Describimos protocolos para medir el pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas en macropinosomas individuales en células vivas. Se hace hincapié en la microscopía ratiométrica de fluoróforos duales y las ventajas que ofrece sobre las técnicas basadas en la población.

Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Este protocolo permite la evaluación en tiempo real de varios procesos y parámetros bioquímicos dentro de la luz de macropinosomas individuales. Estos métodos se pueden emplear para el descubrimiento de fármacos en la biología celular de la macropinocitosis. Este protocolo proporciona la ventaja de revelar heterogeneidad tanto a nivel celular como de orgánulos.Un día antes del ensayo sembrar células Raw264.7 a una densidad de cinco veces 10 a la potencia de las células en 100 microlitros por pozo, en una placa de 96 pozos con fondo de vidrio con lados negros. El día del ensayo verifique si los pozos son al menos 70% confluentes. Luego lave todos los pozos con 100 microlitros de HBSS, precalentados a 37 grados centígrados.A continuación, agregue 100 microlitros de HBSS que contengan 0.025 miligramos por mililitro de TMR etiquetados con 70 kilodalton dextrano y 0.025 miligramos por mililitro de fluoresceína etiquetada con 70 kilodalton dextrano en cada pozo, luego incube las células a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de completar la incubación, retire la placa de la incubadora y lave las células seis veces con 100 microlitros de HBSS. Después del último lavado, agregue 100 microlitros de HBSS precalentado a las células y luego coloque la placa en un microscopio con una etapa y una cámara calentadas.Después de ajustar los parámetros de excitación y emisión para TMR y fluoresceína según sea necesario, adquiera una imagen de cada pozo alternando entre los dos fluoróforos entre cada pozo. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecieron enfocados en toda la placa, luego adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de uno a 15 minutos durante el período de tiempo deseado. Durante la adquisición de la imagen, ajuste el pH de una alícuota de 50 mililitros de una solución rica en potasio tamponada con HEPES 25 milimolares a 7.5 usando ácido clorhídrico molar 10 o hidróxido de potasio molar 10 según sea necesario.Luego ajuste el pH de 350 alícuotas mililitros de la solución rica en potasio tamponada con MES de 25 milimolares a pH 6.5, pH 5.5 y pH 5.0. Una vez que se complete la adquisición de la imagen, retire el HBSS de la placa de 96 pomos que contiene las células y agregue la solución rica en potasio a pH 7.5. Luego agregue nigericina a una concentración final de 10 microgramos por mililitro.Vuelva a colocar la placa en el microscopio y adquiera imágenes de cada pozo utilizando los mismos ajustes de adquisición que se demostraron anteriormente. Para medir los eventos oxidativos dentro de los macropinosomas, seje las células RAW264.7 en una placa de 96 pozos un día antes del ensayo, como se demostró anteriormente. Luego, el día del ensayo, lave todos los pozos con 100 microlitros de HBSS precalentados a 37 grados centígrados.A continuación, agregue 100 microlitros de HBSS que contengan 0.025 miligramos por mililitro de TMR etiquetado con 70 kilodalton dextrano y 0.025 miligramos por mililitro de H2DCFDA etiquetado con 70 kilodalton dextrano a cada pozo, luego incube las células a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de retirar la placa de la incubadora, lave las células seis veces con 100 microlitros de HBSS. Después del último lavado, agregue 100 microlitros de HBSS a cada pozo y coloque la placa en el microscopio.Después de ajustar los parámetros de excitación y emisión para TMR y H2DCFDA según sea necesario, adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de uno a 15 minutos como se demostró anteriormente. Para medir la digestión de proteínas dentro de los macropinosomas, se siembran células RAW264.7 un día antes del ensayo, como se demostró anteriormente. Luego, el día del ensayo, lave todos los pozos con 100 microlitros de HBSS precalentados a 37 grados centígrados.A continuación, agregue 100 microlitros de HBSS que contengan 0.025 miligramos por mililitro de TMR etiquetados con 70 kilodalton dextrano en 0.2 miligramos por mililitro bodipy ovoalbúmina etiquetada a cada pomo. Luego incuba la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de retirar las células de la incubadora, lávelas seis veces con 100 microlitros de HBSS.Después del último lavado, agregue 100 microlitros de HBSS a cada pozo, luego coloque la placa en el microscopio. Después de ajustar los parámetros de excitación y emisión para TMR y BODIPY según sea necesario, adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de uno a 15 minutos como se demostró anteriormente. Al medir el pH, los eventos oxidativos o la degradación de proteínas en macropinosomas, la dinámica de la acidificación no se puede medir durante un cierto período de tiempo correspondiente a la fase de carga de dextrano, que varía según el tipo de célula utilizada.Al medir el pH del macropinosoma, la relación fluoresceína/TMR se hará progresivamente más pequeña y se estabilizará dentro de los 15 minutos de adquisición. Esta meseta corresponde a un pH de aproximadamente cinco, que coincide aproximadamente con el pH de los lisosomas. Al final de cada adquisición, se realiza una calibración in situ.La relación fluoresceína/TMR debe ser mayor dentro del tampón de calibración a pH 7.5 y volverse progresivamente más pequeña a medida que los tampones de calibración se vuelven más ácidos. Esto permite la generación de una curva de calibración. Al medir los eventos oxidativos dentro de los macropinosomas, la proporción de H2DCFDA a TMR se hará progresivamente mayor y probablemente se estabilizará dentro de los primeros 20 a 30 minutos en una célula RAW264.7 activada.Al medir la digestión de proteínas macropinosómicas, se liberará una señal de fluoresceína progresivamente fuerte a medida que se digiera la ovoalbúmina. En las células RAW264.7, el aumento de la fluorescencia liberada de la ovoalbúmina digerida etiquetada con BODIPY, se estabilizará en los primeros 30 minutos. Con este papel emergente en la homeostasis y su relevancia recientemente descubierta para la patología del cáncer, actualmente se está llevando a cabo una investigación de macropinocitosis de renacimiento.Estos métodos se proporcionaron a una caja de herramientas para explorar la contribución de la macropinocitosis a estos campos de estudio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Medición anafilaxia local en ratones

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...