Name: measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Vi tackar University of Calgary för dess stöd. Vi vill också tacka Dr. Robin Yates för tillgång till reagenser, utrustning och användbara diskussioner.

1. Beredning av celler
<ol><li>Odla Raw264,7 celler vid 37 °C och 5% CO2 till 70% sammanflöde i RPMI kompletterat med 10% värmeinaktiverat serum.</li>
	<li>En dag före analysen, så frön Raw264.7 celler med en densitet av 5 x 104 celler per brunn i en 96-brunnsplatta. Se till att varje brunn innehåller 100 μL tillväxtmedium. Se till att 96-brunnsplattan har svarta sidor och en glasbotten för avbildning. OBS: Här användes 96-brunnsplattor för avbildning. 96-brunnsplattorna möjliggö...

<ol>
	<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance.">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Macropinocytosis.">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766 (2017).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li><li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans.">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li><li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1.">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180 (2020).</li><li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes.">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li><li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li><li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies.">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li><li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition.">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li><li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling.">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li><li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT2/ROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling.">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112 (2020).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance.">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).</li><li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging.">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway.">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li><li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy.">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li><li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation.">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens.">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts.">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breadth+of+macropinocytosis+research.">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).</li></ol>

Även om det finns ett antal protokoll för både låg och hög genomströmning mätningar av makropinocytic upptag i makrofager, fibroblaster och även Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, mycket få försök har gjorts att mäta den luminala biokemin i dessa dynamiska fack. Detta beror sannolikt på en brist på sonder som effektivt kan riktas till makr...

Makropinocytos avser upptag av stora mängder extracellulär vätska i membranbundna cytoplasmaorganeller som kallas makropinosomer1,2. Det är en mycket bevarad process som utförs av frilevande encelliga organismer, såsom amoeba Dictyostelium spp. 3, liksom anthozoans4 och metazoaner2. I de flesta celler är makropinocytos en inducerad händelse. Ligaturen av cell-ytreceptorer inducerar utskjutning av aktindrivna plasmamembranförlängningar som kallas volanger. En bråkdel av dessa volanger, av någon dåligt förstådd mekanism, förseglar vid sina distala tips för att bilda makropinosomer (även om det ligger utanför tillämpningsområdet för detta metodpapper, för detaljerade recensioner om mekaniken för makropinocytos, se referenser1,2,5,6,7). Den extracellulära stimulansen som inducerar makropinocytos är oftast en löslig tillväxtfaktor5,8. Följaktligen möjliggör den makropinocytiska händelsen intag av en bolus av extracellulärt material från vilket cellen kan härleda användbara metaboliter för att underlätta tillväxten. Tyvärr kan denna väg för näringstillförsel också driva patologi. Vissa cancerceller hyser mutationer som resulterar i kontinuerlig eller konstituerande makropinocytos. Kontinuerlig leverans av näringsämnen underlättar okontrollerad spridning av cancerceller och har kopplats till särskilt aggressiva tumörer9,10,11,12,13. På samma sätt kan virus inducera makropinocytos för att få tillgång till värdceller, vilket driver viral patologi14.
Makropinocytos fungerar också vid upprätthållande av immunitet mot patogener. Vissa medfödda immunceller som makrofager och dendritiska celler deltar i den konstituerande och aggressiva provtagningen av extracellulär vätska via makropinocytos6,15,16. Detta läge av makropinocytos är otroligt aktivt, och en enda dendritisk cell kan engorge sig med en volym extracellulär vätska som motsvarar sin egen vikt varje timme17. Trots denna konstituerande provtagning replikerar makrofager och dendritiska celler inte okontrollerat liksom tumörceller, istället verkar de bearbeta det extracellulära materialet på ett sådant sätt att information kan extraheras för att informera om förekomsten, eller för den delen frånvaron, av potentiella hot. Information extraheras som i) patogen-associerade molekylära mönster som kan läsas av intracellulära patogen erkännande receptorer och ii) korta sträckor av aminosyror som kan laddas på stora histocompatibility molekyler för screening av celler i det adaptiva immunsystemet16,18,19. Huruvida patogener undergräver denna väg för informationsbehandling av immunceller är för närvarande oklart.
Trots dessa väldefinierade och kritiska roller för makropinocytos i både upprätthållandet av immunitet och homeostas och i motsats till andra vanligare studerade lägen av endocytos, är lite av de inre (luminal) arbete av makropinosomer känt. Att utveckla standardiserade protokoll och verktyg för att studera makropinosomernas luminala biokemi kommer inte bara att hjälpa oss att förstå deras unika biologi bättre utan kommer att ge insikt som kan utnyttjas för nya terapeutiska strategier, inklusive läkemedelsleverans20. Detta metodmanuskript kommer att fokusera på nyligen utvecklade verktyg för att på enorganellnivå dissekera olika aspekter av makropinosomernas luminalbiokemi.
Fluorforer kan användas för att mäta specifika biokemier av organeller om i) de delar företrädesvis in i det intresseområde och/eller ii) de genomgår spektralförändringar som svar på den parameter som är av intresse. Till exempel, när det gäller pH, fluorescerande svaga baser, såsom acridine apelsin, cresyl violett, och LysoTracker färgämnen ackumuleras företrädesvis i sura organeller. Därför är deras relativa intensitet en grov indikation på att den märkta organellen är sur. Andra pH-responsiva fluorforer, såsom fluorescein, pHrodo och cypHer5e, genomgår spektralförändringar vid bindning till protoner (figur 1A-C). Förändringar i fluorescensutsläppet av pH-känsliga fluorforer kan därför ge en användbar approximation av pH. Användningen av enstaka fluorforer innebär dock ett antal nackdelar. Till exempel kan ändringar i fokalplanet, fotoblekning och förändringar i volymen av enskilda organeller, en vanlig förekomst i makropinosomer21, inducera förändringar i fluorescensintensiteten hos enstaka fluorforer, och detta kan inte enkelt korrigeras för22. Envågiga bedömningar, även om de är användbara för visualisering av sura fack, är därför rent kvalitativa.
Ett mer kvantitativt tillvägagångssätt är att rikta in sig på den parameterkänsliga fluorforen tillsammans med en referensfluorofor till organellen av intresse. Referensfluorforen är idealiskt okänslig för biokemiska förändringar inom organellen (figur 1D-F) och kan därför användas för att korrigera för förändringar i brännplanet, organellär volym och i viss utsträckning fotoblekning23. Med hjälp av detta tillvägagångssätt, som kallas dubbelfluorforförhållandet fluorescens, kan korrigering uppnås genom att generera ett förhållande mellan fluorescensutsläppet av parameterkänslig fluorfor och referensfluorforen.
Här kommer protokollet att använda principen om dubbelfluorfor ratiometric imaging för att mäta pH, oxidativa händelser och protein nedbrytning inom makropinosomer. I varje enskilt fall väljs en fluorofor som är känslig för parametern av intresse och en referensfluorofor. För att rikta fluorforerna specifikt till makropinosomer kommer de att kovaly kopplas till 70 kDa dextran, som företrädesvis införlivas i makropinosomer24. Alla analyser kommer att utföras i Raw264,7-celler men kan anpassas till andra celltyper. Om möjligt kalibreras fluorescenskvoterna mot en referenskurva för att få absoluta värden. Viktigt är att alla mätningar utförs i levande celler för dynamisk och kvantitativ bedömning av makropinosomernas luminala miljö.
Vid val av pH-känsliga fluorforer måste ett antal överväganden vägas. Den första är pKa av fluorforen, som anger intervallet av pH-värden vid vilka sonden kommer att vara mest känslig. Om det antas att makropinosomens pH kort efter bildandet kommer att ligga nära det extracellulära mediet (~pH 7.2) och att det gradvis kommer att försuras genom interaktioner med sena endosomer och lysosomer (~pH 5.0), bör en sond med en pKa som är känslig inom det intervallet (figur 2C) väljas. Fluorforfluorescein, som har en pKa på 6,4, är optimalt känslig inom det intervallet. Det har använts i stor utsträckning för att mäta andra liknande organeller, såsom fagosomer, och kommer att vara fluorforen i detta manuskript22,25. Som referensfluorfor kommer tetrametritylramhodamin att användas, vilket är okänsligt för pH(figur 1E). Andra fluorforer, såsom pHrodo och cypHer5e, kan ersätta fluorescein där fluoresceins spektralegenskaper matchar andra experimentella variabler. Några föreslagna referensfluoroforer för pHrodo och cypHer5e visas i figur 1.
En andra faktor är den metod genom vilken de två fluorforerna kommer att riktas specifikt mot makropinosomer. Dextran av storleken 70 kDa, som har en hydrodynamisk radie på ungefär 7 nm, håller sig inte specifikt till celler och ingår i makropinosomer, men inte clathrinbelagda gropar eller grottor, och markerar därför makropinosomer (figur 2A och figur 3A, B)16,24,26. I detta protokoll kommer fluoresceinmärkt 70 kDa dextran- och tetramethylrhodamine (TMR)-märkta 70 kDa dextran att användas som pH-känsliga respektive referenssonder.
I medfödda immunceller representerar makropinocytos och fagocytos de två viktigaste vägarna för internalisering av exogent material för bearbetning och efterföljande presentation till celler i det adaptiva immunsvaret27. Noggrann och samordnad kontroll av redox kemin av lumen av phagosomes och makropinosomer är avgörande för den kontextspecifika bearbetningen av exogent material. Kanske den mest studerade regulatorn av oxidativa händelser i faagosomer är NADPH-oxidasen, ett stort multiunderavdelningskomplex som producerar stora mängder reaktiva syrearter (ROS) inom lumen av phagosomer28. Dess verksamhet är i själva hand central för lämplig antigenbearbetning inom phagosomerna29,30. Ändå har aktiviteten hos NADPH-oxidasen på makropinosomala membran inte utforskats.
I detta protokoll används H2DCFDA succinimidyl ester för att mäta oxidativa händelser inom makropinosomen. Detta är en modifierad form av fluorescein (2',7'-diklordihydrofluorescein diacetat), som är minimalt fluorescerande i sin reducerade form. Vid oxidation ökar dess fluorescensutsläpp avsevärt. Det är dock värt att notera en betydande varning om H2DCFDA - eftersom den är baserad på fluorforfluorescein, är dess fluorescens också släckt i sura fack, och man måste vara noga med att kontrollera denna variabel när man utformar experiment28. I likhet med metoden för mätning av pH kommer H2DCFDA-succinimidylestern att kovaleras till 70 kDa dextran- och TMR-märkta 70 kDa dextran användas som referensfluorfor (figur 3A).
Fluorescerande ovalbumin kommer att användas för att mäta proteinnedbrytning inom makropinosomer. Ovalbumin som används här är tätt märkt med ett 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL färgämne som är självsläckt. Vid matsmältningen frigörs starkt fluorescerande färgmärkta peptider. Eftersom ovalbumin inte lätt kan konjugeras till 70 kDa dextran, kommer celler med TMR-märkta 70 kDa dextran och fluidfas ovalbumin att vara saminkuberade. TMR-signalen kommer att användas för att generera en makropinosommask under analysen efter avbildningen, och signalen som frigörs från den smälta ovalbuminen mäts i masken (figur 3B).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black-walled 96 well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CypHer5e, NHS ester</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA15401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-amino 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ-ovalbumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBurst Green-SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, SE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw264.7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran 70 kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>u-Dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the ph, redox chemistries, and degradative capacity of macropinosomes using dual-fluorophore ratiometric microscopy

Under de senaste åren har området makropinocytos vuxit snabbt. Macropinocytosis har dykt upp som en central mekanism genom vilken medfödda immunceller upprätthåller organismisk homeostas och immunitet. Samtidigt, och i motsats till dess homeostatiska roll, kan det också driva olika patologier, inklusive cancer och virusinfektioner. Till skillnad från andra lägen av endocytos förblir verktygen som utvecklats för att studera mognad av makropinosomer underutvecklade. Här beskriver protokollet nyutvecklade verktyg för att studera redoxmiljön inom lumen av tidiga och mogna makropinosomer. Metoder för användning av ratiometric fluorescensmikroskopi vid bedömning av pH, produktion av reaktiva syre arter och den nedbrytbara kapaciteten inom lumen av enskilda makropinosomer i levande celler beskrivs. Enstaka organelle mätningar erbjuder fördelen att avslöja spatiotemporal heterogenitet, som ofta går förlorad med befolkningsbaserade metoder. Tonvikten läggs på de grundläggande principerna för dubbel fluorfor ratiometric mikroskopi, inklusive sondval, instrumentering, kalibrering och encelliga kontra befolkningsbaserade metoder.

Vid mätning av makropinosom pH finns det en tidsperiod för vilken försurningsdynamiken inte kan mätas. Denna period motsvarar dextran-inläsningsfasen (grå ruta i figur 2C och figur 3C,D) och varierar beroende på vilken celltyp som används. Belastningsfasens längd varierar med i) cellernas makropinocytiska aktivitet och ii) känsligheten hos det instrument som används. Det rekommenderas att justera denna period i början av varje experi...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy at JoVE.com

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

Vi beskriver protokoll för mätning av pH, oxidativa händelser och protein matsmältning i enskilda makropinosomer i levande celler. Tonvikten läggs på dubbelfluoroforkvotetrisk mikroskopi och de fördelar den erbjuder jämfört med befolkningsbaserade tekniker.

Mätning av makropinosomernas pH-, Redoxkemi och degraderande kapacitet med dubbelfluorfor ratiometrisk mikroskopi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Detta protokoll möjliggör realtidsbedömning av olika processer och biokemiska parametrar inom lumen hos enskilda makropinosomer. Dessa metoder kan användas för att läkemedelsupptäckt i cellbiologin hos makropinocytos. Detta protokoll ger fördelen att avslöja heterogenitet på både cellulär och organell nivå.En dag före analysfröet Raw264.7 celler med en densitet av fem gånger 10 till cellernas kraft i 100 mikroliter per brunn, i en glasbotten 96-brunnsplatta med svarta sidor. På testdagen kontrollera om brunnarna är minst 70% konfluenta. Tvätta sedan alla brunnar med 100 mikroliter HBSS, förvärmd vid 37 grader Celsius.Lägg sedan till 100 mikroliter HBSS som innehåller 0,025 milligram per milliliter TMR märkt 70 kilodalton dextran och 0,025 milligram per milliliter fluorescein märkt 70 kilodalton dextran i varje brunn och inkubera sedan cellerna vid 37 grader Celsius i 15 minuter. När inkubationen är klar, ta bort plattan från inkubatorn och tvätta cellerna sex gånger med 100 mikroliter HBSS. Efter den sista tvätten tillsätt 100 mikroliter förvärmd HBSS till cellerna och placera sedan plattan på ett mikroskop med ett uppvärmt steg och kammare.Efter justering av excitations- och utsläppsparametrarna för TMR och fluorescein efter behov, förvärva en bild från varje brunn som växling mellan de två fluorforerna mellan varje brunn. Efter det första förvärvet, kontrollera om alla brunnar förblev i fokus över hela plattan och skaffa sedan bilder av varje brunn med ett till 15 minuters intervall under önskad tid. Under bildförvärvet justerar du pH-talet för en 50 milliliter alikvot av en kaliumrik lösning buffrad med 25 millimolar HEPES till 7,5 med 10 molar saltsyra, eller 10 molar kaliumhydroxid efter behov.Justera sedan pH-talet på 350 milliliter alikvoter av den kaliumrika lösningen buffrad med 25 millimolar MES till pH 6,5, pH 5,5 och pH 5,0. När bildförvärvet är klart, ta bort HBSS från 96-brunnsplattan som innehåller cellerna och tillsätt den kaliumrika lösningen vid pH 7.5. Tillsätt sedan Nigericin vid en slutlig koncentration av 10 mikrogram per milliliter.Placera tillbaka plattan på mikroskopet och skaffa bilder av varje brunn med samma förvärvsinställningar som tidigare visats. För att mäta oxidativa händelser inom makropinosomer, sådd RAW264,7 celler i en 96-brunnsplatta en dag före analysen som visats tidigare. Sedan på testdagen tvätta alla brunnar med 100 mikroliter HBSS förvärmd till 37 grader Celsius.Lägg sedan till 100 mikroliter HBSS som innehåller 0,025 milligram per milliliter TMR märkt 70 kilodalton dextran och 0,025 milligram per milliliter H2DCFDA märkt 70 kilodalton dextran till varje brunn och inkubera sedan cellerna vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Efter att ha tagit bort plattan från inkubatorn tvätta cellerna sex gånger med 100 mikroliter HBSS. Efter den sista tvätten, tillsätt 100 mikroliter HBSS till varje brunn och placera plattan på mikroskopet.Efter justering av excitations- och utsläppsparametrarna för TMR och H2DCFDA efter behov, skaffa bilder av varje brunn med ett till 15 minuters intervall som visats tidigare. För att mäta proteinsammanfattning inom makropinosomer, sådd RAW264,7 celler en dag före analysen, vilket visats tidigare. Sedan på dagen för analysen tvätta alla brunnar med 100 mikroliter HBSS förvärmd vid 37 grader Celsius.Tillsätt sedan 100 mikroliter HBSS som innehåller 0,025 milligram per milliliter TMR märkt 70 kilodalton dextran i 0,2 milligram per milliliter BODIPY märkt ovalbumin till varje brunn. Inkubera sedan plattan vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Efter att ha tagit bort cellerna från inkubatorn, tvätta dem sex gånger med 100 mikroliter HBSS.Efter den sista tvätten tillsätt 100 mikroliter HBSS till varje brunn och placera sedan plattan på mikroskopet. Efter justering av excitations- och utsläppsparametrarna för TMR och BODIPY efter behov, skaffa bilder av varje brunn med ett till 15 minuters intervall som visats tidigare. Vid mätning av pH, oxidativa händelser eller proteinnedbrytning i makropinosomer kan försurningsdynamiken inte mätas under en viss tidsperiod som motsvarar dextranbelastningsfasen, som varierar beroende på vilken celltyp som används.Vid mätning av makropinosom pH blir fluorescein-TMR-förhållandet gradvis mindre och kommer att platå inom 15 minuter efter förvärvet. Denna platå motsvarar ett pH på cirka fem, vilket ungefär matchar lysosomens pH. I slutet av varje förvärv utförs en in situ-kalibrering.Fluorescein-TMR-förhållandet bör vara störst inom kalibreringsbufferten vid pH 7.5 och bli gradvis mindre när kalibreringsbuffertarna blir surare. Detta möjliggör generering av en kalibreringskurva. Vid mätning av oxidativa händelser inom makropinosomer blir förhållandet mellan H2DCFDA och TMR gradvis större och kommer sannolikt att platå inom de första 20 till 30 minuterna i en aktiverad RAW264.7-cell.Vid mätning av makropinosomal protein matsmältning, en progressivt stark fluorescein signal kommer att frigöras som ovalbumin smälts. I RAW264.7-celler kommer ökningen av fluorescens befriad från den smälta BODIPY-märkta ovalbuminen att platå inom de första 30 minuterna. Med denna framväxande roll i homeostas och dess nyupptäckta relevans för cancerpatologi pågår för närvarande en renässans makropinocytos forskning.Dessa metoder tillhandahålls till en verktygslåda för att utforska bidraget från makropinocytos till dessa studieområden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

En cell gratis analyssystem uppskatta neutraliserande förmåga av GM-CSF antikroppar med hjälp av rekombinant Löslig GM-CSF-receptorn

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Mätning Lokala Anafylaxi i möss

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analys av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Att mäta fysiologiska reaktioner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensoriska neuroner till Lipid Feromoner Använda Live Kalcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mätning Phagosome pH genom Propportionell fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Propportionell Imaging av extracellulära pH i Tand Biofilmer

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Imaging den neutrofila fagosomen och Cytoplasma hjälp av en Propportionell pH-indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...