Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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我们感谢金一石和安德鲁·奇斯霍尔姆在研究中给予的最初支持和治疗。细菌菌株OP50由美国国家卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助，由卡诺哈布迪炎遗传学中心（CGC）提供商业利用。我们还感谢达曼德拉·普里对实验程序的标准化。这项研究由国家大脑研究中心的核心赠款资助（由生物技术部支持， 印度政府）、DBT/Wellcome信托印度联盟早期职业补助金（赠款/E/E/18/1/504331）给S.D.，韦康信托-DBT印度联盟中期赠款（赠款#IA/I/13/1/500874）给A.G.-R，以及科学和工程研究委员会（SERB： CRG/2019/002194） 至 A.G.-R.

1. 记者应变：文化与维护
注：为了测量PLM神经元的微管动力学和方向，我们使用蠕虫菌株表达EBP-2：GFP下触摸神经元特异性促进物mec-4（juIs338等位基因）18，25，26。我们使用标准蠕虫培养和维护方法为这个菌株27。
<ol><li>在水中准备线虫生...

多年来，了解微管动力学一直是细胞骨骼研究领域的一个关键焦点。微管经历核化和灾难，以及一个连续的动态不稳定过程44，45，46，47。这些信息大部分是通过体外测定获得的，如自由与聚合的tubulin的光散射读数、荧光管蛋白的微管生长检测等。虽然在薄细?...

神经元有一个精心设计的结构，具有专门的隔间，如树突、细胞体、轴突和突触。神经元细胞骨骼由微管、微丝和神经丝组成，其独特的组织在结构上和功能上支持神经元隔间1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 .多年来，微管组织被确定为神经元极性和功能的关键决定因素。当神经元在发育或再生过程中进行结构改造时，微管动力学和方向决定各种神经元隔间7的身份、偏振传输、生长和发展。因此，评估体内的微管动力学和方向与神经元重塑过程相关是当务之急。
微管由α和β图布林异质体的原体组成，具有动态加端和相对稳定的负端11，12。加尖复合蛋白和相关端结合蛋白的发现，使一个平台能够评估微管组织13。端结合蛋白（EBP）与微管的生长增益端短暂关联，其关联动力学与微管蛋白14、15的生长相关。由于加尖复合物与微管的频繁关联和分离，GFP 标记的 EBP 的点传播功能在计时电影15、16中显示为"彗星"。自从在哺乳动物神经元16中率先观察以来，用荧光蛋白标记的端结合蛋白已经用于确定不同模型系统和神经元类型17、18、19、20、21、22、23的微管动力学。
由于其简单的神经系统和透明的身体 ，C.elegans 已被证明是一个优秀的模型系统，研究神经元改造期间的发展和再生 在体内。在这里，我们描述标记、图像和分析 C. elegans 中触摸神经元发育和再生过程中的微管动力学和生长的方法。使用基因编码的EBP-2：GFP，我们成像PLM神经元的微管，这使我们能够确定微管的极性在这个神经元24的两种不同的神经质。这种方法允许观察和量化EBP彗星作为测量不同细胞环境中的微管动力学，例如，在轴切术后启动轴素再生的微管行为的局部变化可以使用我们的协议进行评估。此检测可以适应不同细胞类型和遗传背景中不同细胞过程中微管动力学的调控。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

在神经元中，微管方向一直是识别轴突的关键评估器，轴突具有加端的微管和树突，通常具有混合方向。在这里，我们描述标记、图像和分析 C. elegans 中触摸神经元发育和再生过程中的微管动力学和生长的方法。我们使用微管尖的基因编码荧光记者，对轴状微管进行成像。使用此协议可以量化在轴切术后启动轴素再生的微管行为的局部变化。这种测定适应其他神经元和遗传背景，以研究微管动力学在各种细胞过程中的调节。

作为一个具有代表性的例子，我们在对EBP彗星的体内观察中描述了PLM神经元的稳定状态和再生轴突。PLM神经元位于蠕虫的尾部区域，具有很长的前过程，形成突触和短后过程。PLM 神经元生长在靠近表皮的前后方向，并负责蠕虫的温和触觉。由于其简化的结构，以及成像和显微外科的便利性，PLM神经元被广泛调查为其微管细胞骨骼29，轴向运输30，31，再生</su...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

提出了一种使用荧光标记的末端结合蛋白对 体内 动态微管进行成像的协议。我们描述了标记、图像和分析 C.elegans后脊柱（PLM）神经元中的动态微管的方法。

在体内卡诺哈布德炎电子神经元微管动力学和方向评估

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

该过程的目的是评估体内的微管组织和动力学。神经元是具有不同轴突、树突和突触区室的极化细胞，由其底层细胞骨架维持。微管形成神经元细胞骨架的大部分，动力学和方向决定了神经元发育和成熟过程中的关键事件。微管由α和β微管蛋白异源二聚体组成，并且具有固有的极化，具有高度动态的正端和稳定的负极。在正端聚合过程中，末端结合蛋白的多分子复合物与原丝瞬时结合并促进微管蛋白二聚体的组装。这项技术将帮助我们可视化体内的神经微管。使用这种技术，可以确定秀丽隐杆线虫神经元发育和再生过程中动态微管的方向和其他参数。我们通常使用这个报告器来可视化感觉神经元中的微管动力学。然而，人们可以在其他细胞类型（如肌肉和皮肤）中表达这种报告器，以可视化这些细胞中的动态微管。荧光标记的末端结合蛋白，如EBP到GFP，在这里显示为彗星。这些彗星的动力学与伴随的微管生长相关，并且是衡量微管动力学和方向的关键指标。为了在特定细胞类型中观察这些彗星，具有EBP-2和GFP DNA的转基因在特定的启动子下表达。对于PLM神经元中的表达，该转基因在助推子下表达。这些转基因蠕虫可以在体视显微镜下观察，并在分类或安装之前设置荧光。为了安装蠕虫以成像EBP彗星，我们在M9缓冲区中制造了10%Argos。并在载玻片上滴一滴。另一张幻灯片用于将液滴压入固化成垫的薄膜中。我们使用0.1微米的聚苯乙烯珠作为安装介质，将一些蠕虫捡起并重新悬浮在珠子溶液中。一个盖玻片被挖走以固定蠕虫并进行成像。安装的可以在任何荧光显微镜上使用相机进行成像，以进行高分辨率成像。该装置配备了旋转磁盘单元，可加快采集速度并减少光漂白和光毒性。幻灯片保持在舞台上，并使用明场照明聚焦和居中蠕虫的场。5X或10X等低倍率物镜可用于此目的。蠕虫可以使用相同的照明在高倍率物镜（如63X）下重新聚焦。该目标为彗星的成像提供了最佳的空间分辨率。PLM神经元的固定居中是在荧光照射下完成的，以防止过度的光照和脾气的光漂白。对于图像采集，我们使用异地发送软件。在明场通道中使用实时成像配置，我们将蠕虫的尾部区域聚焦，并将其居中在视场中。接下来是使用具有488纳米激发光的光成像配置对PNM神经元进行聚焦。对于延时采集，会创建一个实验设置，其中曝光时间、延时持续时间和帧之间的间隔定义了成像的时间技能。对于定量测量，EBP彗星的一些电影将在Image J上进行分析，这是一个开源软件。采集的延时摄影以多图像线的形式打开，可以作为电影预览。在这种特殊的延时过程中，可以在细胞体中，PLM神经元的前后过程中看到彗星。远离细胞体的彗星被归类为正端输出，而那些向细胞体移动的彗星被归类为负端输出。为了开始分析，在感兴趣的区域上绘制一条分段线，在本例中是PLM神经元的内部过程。该线段使用图像的网片功能转换为运动记录仪。运动记录仪是一种距离时间图像，其对角线折痕代表移动的彗星。可以在这些迹线上绘制直线段，并使用分析菜单设置测量参数。这些参数可以在数据分析程序（如Excel）中转换为标准可测量的数量和单位。迹线的宽度对应于生长长度。高点代表生长持续时间，折痕的角度给出了彗星的方向。这些彗星可以进一步分为正端输出和负端输出，以找到微管的相对方向。EBTA GFP的转基因表达可以适应于观察各种细胞环境中的微管动力学，例如新的再生。为了观察区域额定轴突中的微管动力学，使用飞秒激光对轴突进行损伤，这可以精确地切断轴突而不会造成巨大的附带损害。受伤后，蠕虫可以恢复到播种的发动机板上，以便以后观察。PLM神经元显示出强大的外显神经再生，最早可以在损伤后六小时观察到。为了防止光毒性对再生新权利，在旋转的圆盘显微镜中进行实时成像。再生轴突的延时采集可以在以后转换为用于分析彗星的运动记录仪。然后，彗星的距离持续时间和方向可以从微管方向和动力学的角度来解释。我的关键方向和动力学是民用细胞过程的关键决定因素，如细胞分裂，迁移和细胞结构的维持。虽然有许多工具可用于测量微管动力学，但体内测量可能具有挑战性。自花序、光毒性、过度表达伪影和报告强度可变是评估微管动力学的实时观察过程中遇到的一些困难。通过使用具有低浓度脱位DNA和低照明成像的集成转基因技术，本研究已经解决了减轻其中一些挑战的方法。这里描述的成像和分析模块可以扩展到其他基于微管的报告基因和蛋白质转运。这不仅适用于C.elegance神经元，而且可以应用于其他细胞类型和模型系统。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

从胚胎脊髓​​连合神经的解剖和文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

科研

神经科学

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

在 C 在体内激光干切断线虫

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

逆行荧光染料标记允许有针对性的外单细胞记录技术鉴定神经元<em&gt;在体内</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

使用超声波血脑屏障破坏和锰增强MRI的脑功能成像

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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C.在体内神经元钙成像技术线虫

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

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大脑切片生物素化：一个<em&gt;前体内</em&gt;方法来衡量地区特有的质膜蛋白贩运成年神经元

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

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同时<em&gt;体外</em两个由视网膜&gt;功能测试<em&gt;在体内</em&gt;电图系统

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

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比率钙显像对单个神经元的行为线虫线虫

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

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爪蟾Tectal 神经元全细胞膜片钳记录的制备与协议

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

脑切片和原细胞培养中金字塔神经元的弹道标记

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...