Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Vi takker Yishi Jin og Andrew Chisholm for den indledende støtte og den belastning, der anvendes i undersøgelsen. Den bakteriestamme OP50 blev kommercielt benyttet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi takker også Dharmendra Puri for standardiseringen af de eksperimentelle procedurer. Undersøgelsen er finansieret af kernebevillingen fra National Brain Research Centre (støttet af Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT /Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) til S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) til A.G.-R og et tilskud fra Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) til A.G.-R.

1. Reporter stamme: Kultur og vedligeholdelse
BEMÆRK: For at måle mikrotubule dynamik og orientering i PLM neuroner, vi brugte ormen stamme udtrykker EBP-2::GFP under touch neuron specifikke promotor mec-4 (juIs338 allel)18,25,26. Vi bruger standard orm kultur og vedligeholdelse metoder til denne stamme27.
<ol>...

Forståelse af microtubule dynamik har været et centralt fokus inden for cytoskeletal forskning gennem årene. Mikrotubuler gennemgår nucleation og katastrofe sammen med en kontinuerlig proces med dynamisk ustabilitet44,45,46,47. Mange af disse oplysninger er opnået gennem in vitro-analyser som lysspredningsudlæsninger af gratis vs. polymeriseret tubulin, mikrot...

Neuroner har en udførlig arkitektur med specialiserede rum som dendritter, cellelegemer, axoner og synapser. Den neuronale cytoskeleton består af mikrotubuler, mikrofilamenter og neurofilamenter, og deres særskilte organisation understøtter neuronale rum strukturelt og funktionelt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . I årenes løb er mikrotubule organisation blevet identificeret som en nøgledeterminant for neuronal polaritet og funktion. Som neuroner gennemgå strukturelle remodeling under udvikling eller regenerering, microtubule dynamik og orientering bestemme identiteten, polariseret transport, vækst og udvikling af forskellige neuronale rum7. Det er derfor bydende nødvendigt at vurdere mikrotubule dynamik og orientering in vivo at korrelere med neuronal remodeling proces.
Mikrotubuler består af protofilaments af α og β Tubulin heterodimers med dynamiske plus ender og relativt stabile minus ender11,12. Opdagelsen af plus tip komplekse og tilhørende ende bindende proteiner har gjort det muligt for en platform til at vurdere microtubule organisation13. End bindende proteiner (EBP) forbigående forbundet med de voksende plus ender af microtubule og deres forening dynamik er korreleret med væksten af microtubule protofilaments14,15. På grund af hyppig tilknytning og dissociation af plus tip kompleks med microtubule, punkt spredning funktion af GFP-tagged EBP vises som en "komet" i en timelapse film15,16. Siden den banebrydende observation i pattedyr neuroner16, ende bindende proteiner mærket med fluorescerende proteiner er blevet brugt til at bestemme microtubule dynamik på tværs af forskellige modelsystemer og neuron typer17,18,19,20,21,22,23.
På grund af sit enkle nervesystem og gennemsigtige krop har C. elegans vist sig at være et fremragende modelsystem til at studere neuronal remodeling under udvikling og regenerering in vivo. Her beskriver vi metoder til at mærke, billede, og analysere microtubule dynamik og vækst under udvikling og regenerering af touch neuroner i C. elegans. Ved hjælp af genetisk kodet EBP-2::GFP, vi afbildet mikrotubuler i PLM neuron, som tillod os at bestemme polariteten af mikrotubuler i to forskellige neurites af denne neuron24. Denne metode gør det muligt at observere og kvantificere EBP-kometer som et mål for mikrotubuledynamik i forskellige cellulære sammenhænge, for eksempel kan de lokale ændringer i mikrotubuleadfærd, der indleder axonregenerering efter axotomi, vurderes ved hjælp af vores protokol. Denne analyse kan tilpasses til at undersøge reguleringen af microtubule dynamik i forskellige cellulære processer i forskellige celletyper og genetiske baggrunde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

I neuroner, mikrotubule orientering har været en vigtig assessor til at identificere axoner, der har plus-end ud mikrotubuler og dendritter, der generelt har blandet orientering. Her beskriver vi metoder til at mærke, billede, og analysere microtubule dynamik og vækst under udvikling og regenerering af touch neuroner i C. elegans. Ved hjælp af genetisk kodede fluorescerende journalister af microtubule tips, vi afbildet axonal mikrotubuler. De lokale ændringer i microtubule adfærd, der indleder axon regenerering efter axotomi kan kvantificeres ved hjælp af denne protokol. Denne analyse er tilpasningsdygtig til andre neuroner og genetiske baggrunde til at undersøge reguleringen af microtubule dynamik i forskellige cellulære processer.

Som et repræsentativt eksempel har vi beskrevet in vivo observation af EBP kometer i steady-state og regenererende axoner af PLM neuroner. PLM neuroner er placeret i ormens haleregion med en lang forreste proces, der danner en synapse og en kort posteriorproces. PLM neuroner vokser i den forreste-posterior retning tæt på epidermis og er ansvarlige for den blide touch fornemmelse i ormene. På grund af deres forenklede struktur, og amenability til billeddannelse og mikrokirurgi, PLM neuroner er blevet grundigt undersø...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

En protokol til billeddannelse af de dynamiske mikrotubuler in vivo ved hjælp af fluorescerende mærket End bindende protein er blevet præsenteret. Vi beskrev metoderne til at mærke, billede, og analysere de dynamiske mikrotubuler i Posterior lateral microtubule (PLM) neuron af C. elegans.

In vivo Vurdering af Microtubule Dynamics og Orientering i Caenorhabditis elegans Neuroner

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Formålet med denne procedure er at vurdere mikrotubule organisation og dynamik in vivo. Neuroner er polariserede celler med forskellige axonal, dendritiske og synaptiske rum, vedligeholdes af deres underliggende cytoskeleton. Mikrotubuler udgør størstedelen af det neuronale cytoskeleton, og dynamikken og orienteringen bestemmer nøglehændelser under neuronal udvikling og modning.Mikrotubuler består af alfa- og beta tubulin heterodimers, og er i sagens natur polariseret med meget dynamiske plus-ends og stabile minus-ends. Under polymerisering i plus-enderne forbinder et multi molekylært kompleks af endbindende proteiner med protofilamenterne og fremmer samlingen af tubulin dimers. Denne teknik vil hjælpe os med at visualisere neurale mikrotubuler in vivo.Ved hjælp af denne teknik kan man bestemme orienteringen og andre parametre for dynamiske mikrotubuler under udvikling og regenerering af C.elegans neuron. Vi bruger typisk denne reporter til at visualisere microtubule dynamik i sensorisk neuron. Men, man kan udtrykke denne reporter i andre celletyper såsom muskler og hud til at visualisere dynamiske mikrotubuler i disse celler.Fluorescerende mærket slutbinding proteiner som EBP til GFP her, fremstår som kometer. Dynamikken i disse kometer er blevet korreleret med samtidig vækst af mikrotubulerne og en nøgleindikator til måling af mikrotubuledynamik og orientering. For at observere disse kometer i en bestemt celletype udtrykkes transgene med DNA fra EBP-2 og GFP under en bestemt promotor.For udtryk i PLM neuroner, denne transgene er udtrykt under make for promotor. Disse transgene orme kan ses under et stereomikroskop, med fluorescens oprettet før sortering eller montering. Til montering af orme til billedbehandling EBP kometer, laver vi en 10% Argos i M9 buffer.og læg en dråbe på en glasrutschebane. Et andet dias bruges til at trykke dråben ind i en film, der størkner ind i en pude. Vi bruger 0,1 mikron, polystyrenperler som monteringsmedium, et par orme plukkes og suspenderes igen i perleopløsningen.En dæksel slip er pocheret for at immobilisere ormene og taget til billeddannelse. De monterede dem kan afbildes på enhver fluorescens mikroskop med et kamera til høj opløsning billeddannelse. Opsætningen er udstyret med en roterende disk enhed for en hurtigere erhvervelse og reduceret foto blegning og foto toksicitet.Diaset holdes på scenen, og ormefeltet er fokuseret og centreret ved hjælp af lysfeltbelysningen. En lav forstørrelse mål som 5X eller 10X kan bruges til dette formål. Ormene kan re-fokuseret på en høj forstørrelse mål som 63X ved hjælp af den samme belysning.Dette mål giver en optimal rumlig opløsning til billeddannelse af kometer. En fast centrering af PLM neuron sker under fluorescens belysning for at forhindre unødig lys eksponering og foto blegning af prum. Til billederhvervelsen bruger vi sende software fra websteder.Ved hjælp af live imaging konfiguration i brightfield kanal, Vi fokuserer halen regionen af ormen og centrere det i visningsfeltet. Dette efterfølges af fokusering af PNM neuron ved hjælp af lysbilleddannelse konfiguration med 488 nanometer excitation lys. For en time-lapse erhvervelse, er en eksperimentel indstilling skabt, hvor eksponeringstid, varigheden af tiden bortfalder og intervallet mellem rammerne definerer de tidsmæssige færdigheder billeddannelse.Til kvantitative målinger skal nogle film af EBP-kometer analyseres på Image J, som er en open source-software. Den erhvervede time-lapse åbner som en multi-image streng, der kan forhåndsvises som en film. I denne særlige time-lapse, kometer kan ses i cellekroppen, forreste og bageste proces af PLM neuron.Kometerene, der bevæger sig væk fra cellekroppen, er klassificeret som plus-end-out, og de, der bevæger sig mod cellekroppen, klassificeres som minus-end-out. For at begynde analysen trækkes en segmenteret linje over interesseområdet, som i dette tilfælde er den indvendige proces af PLM-neuron. Dette linjesegment omdannes til en kymograf ved hjælp af billedernes reslikfunktion.En kymograf er et afstandstidsbillede med diagonale folder, der repræsenterer de bevægelige kometer. Lige linjesegmenter kan tegnes på disse spor, og måleparametre kan indstilles ved hjælp af analysemenuen. Disse parametre kan konverteres til standardmålelige antal og enheder i dataanalyseprogrammet som Excel.Sporets bredde svarer til vækstlængden. Højdehøjden repræsenterer vækstvarighed, og vinklen på folden giver kometerets retning. Disse kometer kan yderligere klassificeres i plus-end-out og minus-end-out, for at finde den relative orientering af mikrotubuler.Transgent udtryk for EBTA GFP kan tilpasses til at observere microtubule dynamik i forskellige cellulære sammenhæng, såsom ny regenerering. For at observere mikrotubule dynamikken i regionen rating axoner, axon er såret ved hjælp af en femtosecond laser, som kan afskære axon netop uden at forårsage massive følgeskader. Efter skaden kan ormene genvindes på såede motorplader til senere observationer.PLM neuroner viser robust frikendt regenerering, som kan observeres så tidligt som seks timer efter skade. For at forhindre fototoksicitet til at regenerere nye rettigheder, live imaging udføres i en roterende disk mikroskop. Time-lapse erhvervelser af de regenererende axoner kan senere omdannes til kymografer til analyse af kometer.Kometernes afstandsvarighed og retning kan derefter fortolkes med hensyn til mikrotubuleorientering og dynamik. Min kritiske orientering og dynamik er nøglebestemmere af civile cellulære processer som celledeling, migrering og vedligeholdelse af cellulær arkitektur. Selv om der er mange værktøjer til rådighed til måling af microtubule dynamik in vivo måling kan være udfordrende.Autoflorescence, fototoksicitet, over udtryk artefakt, og variable rapporterede intensiteter er nogle af de vanskeligheder, der opstår under levende observation af end-bindende proteiner, at vurdere microtubule dynamik. Ved at bruge en integreret transgen med lav koncentration af deporteret DNA og lav belysning billeddannelse, denne undersøgelse har behandlet metoder til at afbøde nogle af disse udfordringer. De billed- og analysemoduler, der er beskrevet her, kan udvides til andre mikrotubulebaserede reportere og proteintransport.Dette gælder ikke kun for C.elegance neuroner, men kan anvendes til andre celletyper og modelsystemer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd fluorescensmærkning Tillader Målrettet Extracellular Single-unit Optagelse fra Identificerede Neuroner<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium billeddannelse af enkelte neuroner i opfører sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Præparater og protokoller for hele cellen Patch klemme optagelsen af Xenopus laevis Tectal neuroner

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk mærkning af pyramideformede neuroner i hjerneskiver og i primærcellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...