Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Nous remercions Yishi Jin et Andrew Chisholm pour le soutien initial et la souche utilisée dans l’étude. La souche bactérienne OP50 a été utilisée commercialement par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous remercions également Dharmendra Puri pour la standardisation des procédures expérimentales. L’étude est financée par la subvention de base du National Brain Research Centre (soutenu par le Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Subvention # IA / E / 18/1/504331) à S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Subvention # IA / I / 13/1/500874) à A.G.-R et une subvention du Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) à A.G.-R.

1. Souche du rapporteur : Culture et entretien
REMARQUE: Pour mesurer la dynamique et l’orientation des microtubules dans les neurones PLM, nous avons utilisé la souche de ver exprimant EBP-2::GFP sous le promoteur spécifique du neurone tactile mec-4 (allèlejuIs338) 18,25,26. Nous utilisons des méthodes standard de culture et d’entr...

La compréhension de la dynamique des microtubules a été un objectif clé dans le domaine de la recherche sur le cytosquelette au fil des ans. Les microtubules subissent une nucléation et une catastrophe ainsi qu’un processus continu d’instabilité dynamique44,45,46,47. Une grande partie de cette information a été obtenue par des essais in vitro tels que de...

Les neurones ont une architecture élaborée avec des compartiments spécialisés comme les dendrites, les corps cellulaires, les axones et les synapses. Le cytosquelette neuronal est constitué des microtubules, microfilaments et neurofilaments et leur organisation distincte soutient structurellement et fonctionnellement les compartiments neuronaux1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Au fil des ans, l’organisation des microtubules a été identifiée comme un déterminant clé de la polarité et de la fonction neuronales. Au fur et à mesure que les neurones subissent un remodelage structurel au cours du développement ou de la régénération, la dynamique et l’orientation des microtubules déterminent l’identité, le transport polarisé, la croissance et le développement de divers compartiments neuronaux7. Il est donc impératif d’évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules in vivo pour établir une corrélation avec le processus de remodelage neuronal.
Les microtubules sont composés de protofilaments de α et d’hétérodimères de β de tubuline avec des extrémités plus dynamiques et des extrémités moins relativement stables11,12. La découverte du complexe plus tip et des protéines de liaison aux extrémités associées a permis à une plateforme d’évaluer l’organisation des microtubules13. Les protéines de liaison finale (EBP) s’associent transitoirement aux extrémités plus en croissance du microtubule et leur dynamique d’association sont corrélées à la croissance des protofilaments du microtubule14,15. En raison de l’association et de la dissociation fréquentes du complexe de pointe plus avec le microtubule, la fonction d’étalement ponctuel de l’EBP marqué GFP apparaît comme une « comète » dans un film timelapse15,16. Depuis l’observation pionnière dans les neurones des mammifères16,les protéines de liaison d’extrémité marquées avec des protéines fluorescentes ont été utilisées pour déterminer la dynamique des microtubules à travers différents systèmes modèles et types de neurones17,18 , 19,20,21,22,23.
En raison de son système nerveux simple et de son corps transparent, C. elegans s’est avéré être un excellent système modèle pour étudier le remodelage neuronal pendant le développement et la régénération in vivo. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. En utilisant EBP-2::GFP génétiquement codé, nous avons imagé les microtubules dans le neurone PLM, ce qui nous a permis de déterminer la polarité des microtubules dans deux neurites différents de ce neurone24. Cette méthode permet l’observation et la quantification des comètes EBP comme mesure de la dynamique des microtubules dans différents contextes cellulaires, par exemple, les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être évalués à l’aide de notre protocole. Ce test peut être adapté pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires dans divers types de cellules et de milieux génétiques.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

Dans les neurones, l’orientation des microtubules a été un évaluateur clé pour identifier les axones qui ont des microtubules à extrémité plus et des dendrites qui ont généralement une orientation mixte. Nous décrivons ici des méthodes pour étiqueter, imager et analyser la dynamique et la croissance des microtubules au cours du développement et de la régénération des neurones tactiles chez C. elegans. À l’aide de rapporteurs fluorescents génétiquement codés des pointes de microtubules, nous avons imagé les microtubules axonaux. Les changements locaux dans le comportement des microtubules qui initient la régénération axonale après l’axotomie peuvent être quantifiés à l’aide de ce protocole. Ce test est adaptable à d’autres neurones et arrière-plans génétiques pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules dans divers processus cellulaires.

À titre d’exemple représentatif, nous avons décrit l’observation in vivo des comètes EBP à l’état d’équilibre et des axones régénérants des neurones PLM. Les neurones PLM sont situés dans la région de la queue du ver avec un long processus antérieur qui forme une synapse et un court processus postérieur. Les neurones PLM se développent dans la direction antérieure-postérieure près de l’épiderme et sont responsables de la sensation de toucher doux chez les vers. En raison de leur structure sim...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

L’objectif de cette procédure est d’évaluer l’organisation et la dynamique des microtubules in vivo. Les neurones sont des cellules polarisées avec des compartiments axonaux, dendritiques et synaptiques distincts, maintenus par leur cytosquelette sous-jacent. Les microtubules forment la majorité du cytosquelette neuronal, et la dynamique et l’orientation déterminent les événements clés au cours du développement et de la maturation neuronaux.Les microtubules sont composés d’hétérodimères de tubuline alpha et bêta et sont intrinsèquement polarisés avec des extrémités plus dynamiques et des extrémités négatives stables. Lors de la polymérisation aux extrémités plus, un complexe multimoléculaire de protéines de liaison aux extrémités, s’associe transitoirement aux protofilaments et favorise l’assemblage de dimères de tubuline. Cette technique nous aidera à visualiser les microtubules neuronaux in vivo.En utilisant cette technique, on peut déterminer l’orientation et d’autres paramètres des microtubules dynamiques au cours du développement et de la régénération du neurone C.elegans. Nous utilisons généralement ce rapporteur pour visualiser la dynamique des microtubules dans les neurones sensoriels. Cependant, on peut exprimer ce rapporteur dans d’autres types de cellules telles que les muscles et la peau pour visualiser des microtubules dynamiques dans ces cellules.Les protéines de liaison finale étiquetées par fluorescence, comme l’EBP à la GFP, apparaissent ici sous forme de comètes. La dynamique de ces comètes a été corrélée avec la croissance concomitante des microtubules, et un indicateur clé pour évaluer la dynamique et l’orientation des microtubules. Afin d’observer ces comètes dans un type cellulaire spécifique, les transgènes avec l’ADN de l’EBP-2 et du GFP sont exprimés sous un promoteur spécifique.Pour l’expression dans les neurones PLM, ce transgène est exprimé sous le make for promoter. Ces vers transgéniques peuvent être vus au stéréomicroscope, avec une fluorescence mise en place avant le tri ou le montage. Pour le montage des vers pour l’imagerie des comètes EBP, nous fabriquons un tampon 10% Argos in M9.et placez une goutte sur une lame de verre. Une autre diapositive est utilisée pour presser la goutte dans un film qui se solidifie en un tampon. Nous utilisons des billes de polystyrène de 0,1 micron comme support de montage, quelques vers sont cueillis et re-suspendus dans la solution de perles.Un bordereau de couverture est braconné pour immobiliser les vers et pris pour imagerie. Ceux montés peuvent être imagés sur n’importe quel microscope à fluorescence avec une caméra pour une imagerie haute résolution. La configuration est équipée d’une unité de disque rotatif pour une acquisition plus rapide et une réduction du blanchiment photo et de la phototoxicité.La diapositive est maintenue sur la scène et le champ de vers est focalisé et centré à l’aide de l’éclairage en champ lumineux. Un objectif à faible grossissement comme 5X ou 10X peut être utilisé à cette fin. Les vers peuvent être recentrés à un objectif de grossissement élevé comme 63X en utilisant le même éclairage.Cet objectif fournit une résolution spatiale optimale pour l’imagerie des comètes. Un centrage fixe du neurone PLM est effectué sous l’éclairage de fluorescence pour éviter une exposition indue à la lumière et un photo-blanchiment du prum. Pour l’acquisition d’images, nous utilisons un logiciel d’envoi hors des sites.En utilisant la configuration d’imagerie en direct dans le canal de champ lumineux, nous concentrons la région de la queue du ver et la centrons dans le champ de vision. Ceci est suivi par la focalisation du neurone PNM en utilisant une configuration d’imagerie lumineuse avec une lumière d’excitation de 488 nanomètres. Pour une acquisition time-lapse, un cadre expérimental est créé où le temps d’exposition, la durée du time-lapse et l’intervalle entre les images définissent les compétences temporelles de l’imagerie.Pour les mesures quantitatives, certains films de comètes EBP doivent être analysés sur Image J, qui est un logiciel open source. Le time-lapse acquis s’ouvre sous la forme d’un brin multi-images, qui peut être prévisualisé sous forme de film. Dans ce time-lapse particulier, des comètes peuvent être vues dans le corps cellulaire, processus antérieur et postérieur du neurone PLM.Les comètes qui s’éloignent du corps cellulaire sont classées comme plus-end-out, et celles se déplaçant vers le corps cellulaire sont classées comme minus-end-out. Pour commencer l’analyse, une ligne segmentée est tracée sur la région d’intérêt, qui dans ce cas est le processus intérieur du neurone PLM. Ce segment de ligne est converti en kymographe à l’aide de la fonction de reslice des images.Un kymographe est une image de distance temporelle avec des plis diagonals représentant les comètes en mouvement. Des segments de ligne droite peuvent être dessinés sur ces traces et les paramètres de mesure peuvent être définis à l’aide du menu d’analyse. Ces paramètres peuvent être convertis en quantités et unités mesurables standard dans le programme d’analyse de données comme Excel.La largeur de la trace correspond à la longueur de croissance. La hauteur représente la durée de croissance, et l’angle du pli donne la direction des comètes. Ces comètes peuvent en outre être classées en plus-end-out et minus-end-out, pour trouver l’orientation relative des microtubules.L’expression transgénique de l’EBTA GFP peut être adaptée pour observer la dynamique des microtubules dans divers contextes cellulaires, tels que la nouvelle régénération. Pour observer la dynamique des microtubules dans la région évaluant les axones, l’axone est blessé à l’aide d’un laser femtoseconde, qui peut couper l’axone avec précision sans causer de dommages collatéraux massifs. Après la blessure, les vers peuvent être récupérés sur des plaques de moteur ensemencées pour des observations ultérieures.Les neurones PLM présentent une régénération exonérée robuste, qui peut être observée dès six heures après la blessure. Pour éviter la phototoxicité à la régénération de nouveaux droits, l’imagerie en direct est réalisée dans un microscope à disque rotatif. Les acquisitions en accéléré des axones en régénération peuvent ensuite être converties en kymographes pour l’analyse des comètes.La durée et la direction de la distance des comètes peuvent alors être interprétées en termes d’orientation et de dynamique des microtubules. Mon orientation critique et ma dynamique sont des déterminants clés des processus cellulaires civils tels que la division cellulaire, la migration et la maintenance de l’architecture cellulaire. Bien qu’il existe de nombreux outils disponibles pour la mesure de la dynamique des microtubules, la mesure in vivo peut être difficile.L’autoflorescence, la phototoxicité, l’artefact de sur-expression et les intensités variables rapportées sont quelques-unes des difficultés rencontrées lors de l’observation en direct des protéines de liaison finale, pour évaluer la dynamique des microtubules. En utilisant un transgénique intégré avec une faible concentration d’ADN déporté et une imagerie à faible éclairage, cette étude a abordé des méthodes pour atténuer certains de ces défis. Les modules d’imagerie et d’analyse décrits ici peuvent être étendus à d’autres rapporteurs à base de microtubules et au transport de protéines.Ceci n’est pas seulement applicable aux neurones C.elegance, mais peut être appliqué à d’autres types de cellules et systèmes modèles.

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