Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Wir danken Yishi Jin und Andrew Chisholm für die anfängliche Unterstützung und die in der Studie verwendete Sorte. Der Bakterienstamm OP50 wurde kommerziell vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) in Anspruch genommen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde. Wir danken auch Dharmendra Puri für die Standardisierung der experimentellen Verfahren. Die Studie wird durch den Kernzuschuss des National Brain Research Centre (unterstützt vom Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18 / 1 / 504331) an S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13 / 1 / 1 / 500874) an A.G.-R und einen Zuschuss des Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) an A.G.-R.

1. Reporter-Sorte: Kultur und Pflege
HINWEIS: Um die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in den PLM-Neuronen zu messen, verwendeten wir den Wurmstamm, der EBP-2::GFP unter dem Berührungsneuron-spezifischen Promotor mec-4 (juIs338-Allel) 18,25,26exprimiert. Für diesen Stamm verwenden wir Standard-Wurmkultur- und Wartungsmethoden<sup c...

Das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik war im Laufe der Jahre ein Schwerpunkt auf dem Gebiet der Zytoskelettforschung. Mikrotubuli durchlaufen Keimbildung und Katastrophe zusammen mit einem kontinuierlichen Prozess dynamischer Instabilität44,45,46,47. Viele dieser Informationen wurden durch In-vitro-Assays wie Lichtstreuanzeigen von freiem vs. polymerisiertem Tub...

Neuronen haben eine ausgeklügelte Architektur mit spezialisierten Kompartimenten wie Dendriten, Zellkörpern, Axonen und Synapsen. Das neuronale Zytoskelett besteht aus den Mikrotubuli, Mikrofilamenten und Neurofilamenten und ihre unterschiedliche Organisation unterstützt die neuronalen Kompartimente strukturell und funktionell1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10 . Im Laufe der Jahre wurde die Organisation von Mikrotubuli als Schlüsseldeterminante für neuronale Polarität und Funktion identifiziert. Da Neuronen während der Entwicklung oder Regeneration einem strukturellen Umbau unterzogen werden, bestimmen die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli die Identität, den polarisierten Transport, das Wachstum und die Entwicklung verschiedener neuronaler Kompartimente7. Es ist daher unerlässlich, die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in vivo zu bewerten, um mit dem neuronalen Umbauprozess zu korrelieren.
Mikrotubuli bestehen aus Protofilamenten α und β Tubulin-Heterodimeren mit dynamischen Plusenden und relativ stabilen Minusenden11,12. Die Entdeckung des Plus-Tip-Komplexes und der damit verbundenen Endbindungsproteine haben es einer Plattform ermöglicht, die Mikrotubuli-Organisation zu bewerten13. Endbindungsproteine (EBP) assoziieren sich vorübergehend mit den wachsenden Plusenden der Mikrotubuli und ihre Assoziationsdynamik korreliert mit dem Wachstum der Mikrotubuli-Protofilamente14,15. Aufgrund der häufigen Assoziation und Dissoziation von Plusspitzenkomplex mit dem Mikrotubuli erscheint die Punktspreizfunktion von GFP-getaggtem EBP als "Komet" in einem Zeitrafferfilm15,16. Seit der bahnbrechenden Beobachtung in Säugetierneuronen16werden Endbindungsproteine, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, verwendet, um die Mikrotubulidynamik über verschiedene Modellsysteme und Neuronentypen17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen.
Aufgrund seines einfachen Nervensystems und seines transparenten Körpers hat sich C. elegans als hervorragendes Modellsystem erwiesen, um den neuronalen Umbau während der Entwicklung und Regeneration in vivo zu untersuchen. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodiertem EBP-2::GFP haben wir die Mikrotubuli im PLM-Neuron abgebildet, wodurch wir die Polarität der Mikrotubuli in zwei verschiedenen Neuriten dieses Neurons24bestimmen konnten. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung der EBP-Kometen als Maß für die Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Kontexten, zum Beispiel können die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonischer Axotomie initiieren, mit unserem Protokoll beurteilt werden. Dieser Assay kann angepasst werden, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen in verschiedenen Zelltypen und genetischen Hintergründen zu untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

In Neuronen war die Mikrotubuliorientierung ein Schlüsselbewerter, um Axone zu identifizieren, die Plus-End-Out-Mikrotubuli und Dendriten haben, die im Allgemeinen eine gemischte Orientierung haben. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern von Mikrotubuli-Spitzen haben wir die axonalen Mikrotubuli abgebildet. Die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonerektomie initiieren, können mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Dieser Assay ist an andere Neuronen und genetische Hintergründe anpassbar, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen zu untersuchen.

Als repräsentatives Beispiel haben wir die in vivo Beobachtung der EBP-Kometen in den stationären und regenerierenden Axonen der PLM-Neuronen beschrieben. PLM-Neuronen befinden sich im Schwanzbereich des Wurms mit einem langen vorderen Prozess, der eine Synapse und einen kurzen hinteren Prozess bildet. PLM-Neuronen wachsen in vorderer und hinterer Richtung nahe der Epidermis und sind für das sanfte Berührungsgefühl bei den Würmern verantwortlich. Aufgrund ihrer vereinfachten Struktur und ihrer Zugänglichkeit für ...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Organisation und Dynamik der Mikrotubuli in vivo zu bewerten. Neuronen sind polarisierte Zellen mit ausgeprägten axonalen, dendritischen und synaptischen Kompartimenten, die durch ihr zugrunde liegendes Zytoskelett aufrechterhalten werden. Mikrotubuli bilden den Großteil des neuronalen Zytoskeletts, und die Dynamik und Orientierung bestimmen Schlüsselereignisse während der neuronalen Entwicklung und Reifung.Mikrotubuli bestehen aus Alpha- und Beta-Tubulin-Heterodimeren und sind von Natur aus polarisiert mit hochdynamischen Plus-Enden und stabilen Minus-Enden. Während der Polymerisation an den Plus-Enden assoziiert sich ein multimolekularer Komplex von endbindenden Proteinen vorübergehend mit den Protofilamenten und fördert den Aufbau von Tubulindimeren. Diese Technik wird uns helfen, neuronale Mikrotubuli in vivo zu visualisieren.Mit dieser Technik kann man die Orientierung und andere Parameter dynamischer Mikrotubuli während der Entwicklung und Regeneration des C.elegans-Neurons bestimmen. Wir verwenden diesen Reporter typischerweise, um die Dynamik von Mikrotubuli in sensorischen Neuronen zu visualisieren. Man kann diesen Reporter jedoch in anderen Zelltypen wie Muskeln und Haut ausdrücken, um dynamische Mikrotubuli in diesen Zellen zu visualisieren.Fluoreszenzmarkierte endbindende Proteine wie EBP zu GFP erscheinen hier als Kometen. Die Dynamik dieser Kometen wurde mit dem gleichzeitigen Wachstum der Mikrotubuli korreliert und ist ein Schlüsselindikator zur Messung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli. Um diese Kometen in einem bestimmten Zelltyp zu beobachten, werden Transgene mit DNA aus EBP-2 und GFP unter einem spezifischen Promotor exprimiert.Für die Expression in den PLM-Neuronen wird dieses Transgen unter der Marke für Promotor exprimiert. Diese transgenen Würmer können unter einem Stereomikroskop betrachtet werden, wobei die Fluoreszenz vor dem Sortieren oder Montieren eingerichtet wird. Für die Montage der Würmer zur Abbildung von EBP-Kometen stellen wir 10% Argos in M9-Puffer her.und legen Sie einen Tropfen auf eine Glasrutsche. Ein weiteres Dia wird verwendet, um den Tropfen in einen Film zu drücken, der sich zu einem Pad verfestigt. Wir verwenden 0,1 Mikrometer, Polystyrolperlen als Montagemedium, ein paar Würmer werden gepflückt und in der Perlenlösung wieder aufgehängt.Ein Deckzettel wird pochiert, um die Würmer zu immobilisieren und zur Bildgebung genommen. Die montierten können auf jedem Fluoreszenzmikroskop mit einer Kamera für hochauflösende Bildgebung abgebildet werden. Das Setup ist mit einer rotierenden Scheibeneinheit für eine schnellere Erfassung und reduzierte Fotobleiche und Fototoxizität ausgestattet.Das Dia wird auf der Bühne gehalten und das Wurmfeld mit der Hellfeldbeleuchtung fokussiert und zentriert. Ein Objektiv mit geringer Vergrößerung wie 5X oder 10X kann für diesen Zweck verwendet werden. Die Würmer können bei gleicher Beleuchtung bei einem Objektiv mit hoher Vergrößerung wie 63X neu fokussiert werden.Dieses Objektiv bietet eine optimale räumliche Auflösung für die Abbildung der Kometen. Eine feste Zentrierung des PLM-Neurons erfolgt unter der Fluoreszenzbeleuchtung, um eine übermäßige Lichteinwirkung und Fotobleiche des Prums zu verhindern. Für die Bilderfassung verwenden wir Sendesoftware außerhalb von Standorten.Mit der Live-Imaging-Konfiguration im Hellfeldkanal fokussieren wir die Schwanzregion des Wurms und zentrieren sie im Sichtfeld. Es folgt die Fokussierung des PNM-Neurons mittels Lichtbildgebungskonfiguration mit 488 Nanometer Anregungslicht. Für eine Zeitraffererfassung wird eine experimentelle Einstellung erstellt, in der die Belichtungszeit, die Dauer des Zeitraffers und das Intervall zwischen den Frames die zeitlichen Fähigkeiten der Bildgebung definieren.Für quantitative Messungen sollen einige Filme von EBP-Kometen auf Image J, einer Open-Source-Software, analysiert werden. Der erfasste Zeitraffer öffnet sich als Multi-Image-Strang, der als Film in der Vorschau angezeigt werden kann. In diesem speziellen Zeitraffer sind Kometen im Zellkörper, im vorderen und hinteren Prozess des PLM-Neurons zu sehen.Die Kometen, die sich vom Zellkörper entfernen, werden als Plus-Ende-Out klassifiziert, und diejenigen, die sich in Richtung des Zellkörpers bewegen, werden als Minus-Ende-Out klassifiziert. Um die Analyse zu beginnen, wird eine segmentierte Linie über die interessierende Region gezogen, die in diesem Fall der innere Prozess des PLM-Neurons ist. Dieses Liniensegment wird mit hilfe der Reslice-Funktion von Bildern in einen Kymographen umgewandelt.Ein Kymograph ist ein Distanzzeitbild mit diagonalen Falten, die die sich bewegenden Kometen darstellen. Auf diesen Leiterbahnen können geradlinige Segmente gezeichnet und Messparameter über das Analysemenü eingestellt werden. Diese Parameter können im Datenanalyseprogramm wie Excel in messbare Standardgrößen und -einheiten konvertiert werden.Die Breite der Leiterbahn entspricht der Wachstumslänge. Die Höhe stellt die Wachstumsdauer dar, und der Winkel der Falte gibt die Richtung der Kometen an. Diese Kometen können weiter in Plus-Ende-Out und Minus-End-Out klassifiziert werden, um die relative Orientierung von Mikrotubuli zu finden.Die transgene Expression von EBTA GFP kann angepasst werden, um die Dynamik von Mikrotubuli in verschiedenen zellulären Kontexten zu beobachten, z. B. bei der Neuregeneration. Um die Mikrotubulidynamik in den Region Rating Axons zu beobachten, wird das Axon mit einem Femtosekundenlaser verletzt, der das Axon präzise durchtrennen kann, ohne massive Kollateralschäden zu verursachen. Nach der Verletzung können die Würmer für spätere Beobachtungen auf ausgesäten Motorplatten geborgen werden.PLM-Neuronen zeigen eine robuste Exoneree-Regeneration, die bereits sechs Stunden nach der Verletzung beobachtet werden kann. Um eine Phototoxizität zur Regeneration neuer Rechte zu verhindern, wird eine Live-Bildgebung in einem rotierenden Scheibenmikroskop durchgeführt. Zeitrafferaufnahmen der sich regenerierenden Axone können später in Kymographen für die Analyse von Kometen umgewandelt werden.Die Entfernungsdauer und -richtung der Kometen kann dann in Bezug auf die Orientierung und Dynamik von Mikrotubuli interpretiert werden. Meine kritische Orientierung und Dynamik sind Schlüsselfaktoren ziviler zellulärer Prozesse wie Zellteilung, Migration und Aufrechterhaltung der Zellarchitektur. Obwohl es viele Werkzeuge für die Messung der Mikrotubulidynamik gibt, kann die In-vivo-Messung eine Herausforderung darstellen.Autofluoreszenz, Phototoxizität, Überexpressionsartefakt und variabel berichtete Intensitäten sind einige der Schwierigkeiten, die bei der Live-Beobachtung von endbindenden Proteinen auftreten, um die Mikrotubulidynamik zu beurteilen. Durch die Verwendung eines integrierten transgenen Mittels mit geringer Konzentration deportierter DNA und geringer Beleuchtungsbildgebung hat sich diese Studie mit Methoden befasst, um einige dieser Herausforderungen zu mildern. Die hier beschriebenen Bildgebungs- und Analysemodule können auf andere Mikrotubuli-basierte Reporter und Proteintransporte ausgeweitet werden.Dies gilt nicht nur für C.elegance-Neuronen, sondern auch für andere Zelltypen und Modellsysteme.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

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Forschung

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Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...