Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
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हम प्रारंभिक समर्थन और अध्ययन में इस्तेमाल तनाव के लिए Yishi जिन और एंड्रयू Chisholm शुक्रिया अदा करते हैं । बैक्टीरियल स्ट्रेन OP50 को अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रमों (P40 OD010440) के एनआईएच कार्यालय द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से व्यावसायिक रूप से लाभ उठाया गया था। हम प्रायोगिक प्रक्रियाओं के मानकीकरण के लिए धर्मेंद्र पुरी को भी धन्यवाद देते हैं। अध्ययन राष्ट्रीय मस्तिष्क अनुसंधान केंद्र के कोर अनुदान द्वारा वित्त पोषित है (जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित, भारत सरकार), डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट इंडिया एलायंस अर्ली करियर ग्रांट (ग्रांट# आईए/ई/18/1/504331) एसडी को, वेलकम ट्रस्ट-डीबीटी इंडिया एलायंस इंटरमीडिएट ग्रांट (ग्रांट# आईए/आई/आई/13/1/500874) को ए.जी.आर और साइंस एंड इंजीनियरिंग रिसर्च बोर्ड (एसईआरबी) से ग्रांट: सीआरजी/2019/002194) से एग-आर

1. रिपोर्टर तनाव: संस्कृति और रखरखाव
नोट: पीएलएम न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास को मापने के लिए, हमने ईबीपी-2:: जीएफपी के तहत स्पर्श न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर mec-4 <em...

माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता को समझना पिछले कुछ वर्षों में साइटोस्केलेल अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित किया गया है। माइक्रोट्यूब्यूल्स को नाभिक और तबाही से गुजरना पड़ा और गतिशी?...

न्यूरॉन्स में एक विस्तृत वास्तुकला होती है जिसमें विशेष डिब्बों जैसे डेंड्राइट्स, सेल बॉडीज, एक्सॉन और सिनेप्स होते हैं। न्यूरोनल साइटोस्केलेटन माइक्रोट्यूबुल्स, माइक्रोफिलामेंट्स और न्यूरोफिलामेंट्स का गठन किया जाता है और उनका अलग संगठन न्यूरोनल डिब्बों को संरचनात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 का समर्थन करता है . इन वर्षों में, माइक्रोट्यूबुल संगठन को न्यूरोनल ध्रुवता और कार्य के एक प्रमुख निर्धारक के रूप में पहचाना गया है। चूंकि न्यूरॉन्स विकास या पुनर्जनन के दौरान संरचनात्मक पुनर्मॉडलिंग से गुजरते हैं, माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास पहचान, ध्रुवीकृत परिवहन, विकास और विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों के विकास को निर्धारित करते हैं7। इसलिए, न्यूरोनल रिमॉडलिंग प्रक्रिया से सहसंबंधित करने के लिए वीवो में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और अभिविन्यास का आकलन करना अनिवार्य है।
माइक्रोट्यूबुल्स α और β तुबुलिन हेट्रोडिमर्स के प्रोटोफिलामेंट्स से मिलकर गतिशील प्लस सिरों और अपेक्षाकृत स्थिर माइनस11,12समाप्त होता है । प्लस टिप कॉम्प्लेक्स और संबंधित अंत बाध्यकारी प्रोटीन की खोज ने माइक्रोट्यूबुले संगठन13का आकलन करने के लिए एक मंच सक्षम किया है । माइक्रोट्यूबुल के बढ़ते प्लस सिरों के साथ अंतिम बाध्यकारी प्रोटीन (ईबीपी) क्षणिक रूप से संबद्ध होते हैं और उनकी संघ गतिशीलता माइक्रोटुबुल प्रोटोफिलामेंट्स14, 15के विकास से सहसंबद्ध होती है। माइक्रोट्यूबुले के साथ प्लस टिप कॉम्प्लेक्स के लगातार सहयोग और वियोजन के कारण, जीएफपी-टैग किए गए ईबीपी का बिंदु प्रसार कार्य टाइमलैप्स मूवी15,16में "धूमकेतु" के रूप में दिखाई देता है। चूंकि स्तनधारी न्यूरॉन्स16में अग्रणी अवलोकन के बाद से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए अंतिम बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग विभिन्न मॉडल प्रणालियों और न्यूरॉन प्रकार 17 , 18 ,19, 20 ,22,22,23में माइक्रोटुबुल गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए किया गया है ।
अपने सरल तंत्रिका तंत्र और पारदर्शी शरीर के कारण, सी एलिगेंस वीवो मेंविकास और उत्थान के दौरान न्यूरोनल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली साबित हुई है। यहां हम सी एलिगेंस में टच न्यूरॉन्स के विकास और पुनर्जनन के दौरान माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और विकास को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड ईबीपी-2:: जीएफपी का उपयोग करके, हमने पीएलएम न्यूरॉन में माइक्रोट्यूबुल्स को चित्रित किया, जिसने हमें इस न्यूरॉन24के दो अलग-अलग न्यूराइट्स में माइक्रोट्यूबुल्स की ध्रुवीयता निर्धारित करने की अनुमति दी। यह विधि विभिन्न सेलुलर संदर्भों में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता के उपाय के रूप में ईबीपी धूमकेतु के अवलोकन और मात्राकरण की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में स्थानीय परिवर्तन जो एक्सोटॉमी के बाद एक्सोन पुनर्जनन शुरू करते हैं, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। इस परख को विविध सेल प्रकारों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के नियमन की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

न्यूरॉन्स में, माइक्रोट्यूबुल ओरिएंटेशन उन एक्सॉन की पहचान करने के लिए एक प्रमुख निर्धारक रहा है जिनमें माइक्रोट्यूबुल्स और डेंड्राइट्स को प्लस-एंड किया जाता है जो आम तौर पर मिश्रित अभिविन्यास होते हैं। यहां हम सी एलिगेंस में टच न्यूरॉन्स के विकास और पुनर्जनन के दौरान माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और विकास को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। माइक्रोट्यूबुले टिप्स के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करके, हमने एक्सोनल माइक्रोट्यूबुल्स को इमेज किया। एक्सोटॉमी के बाद एक्सोन पुनर्जनन शुरू करने वाले माइक्रोट्यूबुल व्यवहार में स्थानीय परिवर्तनों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यह परख विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता के नियमन की जांच करने के लिए अन्य न्यूरॉन्स और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलनीय है।

एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हमने स्थिर राज्य में ईबीपी धूमकेतु के वीवो अवलोकन और पीएलएम न्यूरॉन्स के एक्सॉन को पुनर्जीवित करने का वर्णन किया है। पीएलएम न्यूरॉन्स एक लंबी पूर्वकाल प्रक्रिया के सा?...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

फ्लोरोसेंटली लेबल एंड बाइंडिंग प्रोटीन का उपयोग करके वीवो में गतिशील माइक्रोट्यूबुल्स इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। हमने सी एलिगेंसके पीछे पार्श्व माइक्रोट्यूबल (पीएलएम) न्यूरॉन में गतिशील माइक्रोट्यूबुल्स को लेबल, छवि और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया।

वीवो में कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स और ओरिएंटेशन का आकलन

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

इस प्रक्रिया का उद्देश्य वीवो में माइक्रोट्यूबुले संगठन और गतिशीलता का आकलन करना है। न्यूरॉन्स अलग अक्षीय, डेंड्रिटिक, और सिनैप्टिक डिब्बों के साथ ध्रुवीकृत कोशिकाओं, उनके अंतर्निहित साइटोस्केलेटन द्वारा बनाए रखा जाता है। माइक्रोट्यूबुल्स न्यूरोनल साइटोस्केलेटन के बहुमत के रूप में, और गतिशीलता और अभिविन्यास न्यूरोनल विकास और परिपक्वता के दौरान प्रमुख घटनाओं का निर्धारण करते हैं।माइक्रोट्यूबुल्स में अल्फा और बीटा ट्यूबलिन हेट्रोडिमर्स शामिल हैं, और स्वाभाविक रूप से अत्यधिक गतिशील प्लस-एंड्स और स्थिर माइनस-सिरों के साथ ध्रुवीकृत होते हैं। प्लस-एंड्स पर बहुलकीकरण के दौरान, अंत-बाध्यकारी प्रोटीन का एक बहु-आणविक परिसर, क्षणिक रूप से प्रोटोफिलामेंट्स के साथ संबद्ध होता है और ट्यूबलिन डिमर्स की असेंबली को बढ़ावा देता है। इस तकनीक से हमें वीवो में न्यूरल माइक्रोट्यूबल्स की कल्पना करने में मदद मिलेगी।इस तकनीक का उपयोग करके, सी एलिगेंस न्यूरॉन के विकास और पुनर्जनन के दौरान गतिशील माइक्रोट्यूबल्स के अभिविन्यास और अन्य मापदंडों को निर्धारित कर सकते हैं। हम आम तौर पर संवेदी न्यूरॉन में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता की कल्पना करने के लिए इस रिपोर्टर का उपयोग करते हैं। हालांकि, इन कोशिकाओं में गतिशील माइक्रोट्यूबल की कल्पना करने के लिए मांसपेशियों और त्वचा जैसे अन्य सेल प्रकारों में इस रिपोर्टर को व्यक्त कर सकते हैं।फ्लोरोसेंटली ने यहां जीपीपी से जीएफपी जैसे एंड-बाइंडिंग प्रोटीन को लेबल किया, धूमकेतु के रूप में दिखाई देते हैं । इन धूमकेतुओं की गतिशीलता को माइक्रोट्यूबल के सहवर्ती विकास के साथ सहसंबद्ध किया गया है, और माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता और अभिविन्यास को मापने के लिए एक प्रमुख संकेतक है। एक विशिष्ट सेल प्रकार में इन धूमकेतुओं का निरीक्षण करने के लिए, ईबीपी-2 और जीएफपी के डीएनए के साथ ट्रांसजीन एक विशिष्ट प्रमोटर के तहत व्यक्त किए जाते हैं।पीएलएम न्यूरॉन्स में अभिव्यक्ति के लिए, यह ट्रांसजीन मेक फॉर प्रमोटर के तहत व्यक्त किया जाता है। इन ट्रांसजेनिक कीड़े को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है, जिसमें छंटाई या बढ़ते से पहले फ्लोरेसेंस स्थापित किया जाता है। इमेजिंग ईबीपी धूमकेतु के लिए कीड़े बढ़ते के लिए, हम M9 बफर में एक 10% Argos बनाते हैं ।और एक गिलास स्लाइड पर एक बूंद रखें। एक और स्लाइड का उपयोग ड्रॉप को एक फिल्म में दबाने के लिए किया जाता है जो पैड में जम जाता है। हम बढ़ते माध्यम के रूप में 0.1 माइक्रोन, पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग करते हैं, कुछ कीड़े को उठाया जाता है और मनका समाधान में फिर से निलंबित कर दिया जाता है।कीड़े को स्थिर करने और इमेजिंग के लिए ली गई कवर स्लिप का शिकार किया जाता है। घुड़सवार लोगों को उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक कैमरे के साथ किसी भी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया जा सकता है। सेटअप एक तेजी से अधिग्रहण और कम फोटो ब्लीचिंग और फोटो विषाक्तता के लिए एक कताई डिस्क इकाई से सुसज्जित है ।स्लाइड मंच पर रखा जाता है और कीड़े के क्षेत्र केंद्रित है और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर केंद्रित है । इस उद्देश्य के लिए 5X या 10X जैसे कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग किया जा सकता है। कीड़े को एक ही रोशनी का उपयोग करके 63X जैसे उच्च आवर्धन उद्देश्य पर फिर से केंद्रित किया जा सकता है।यह उद्देश्य धूमकेतु की इमेजिंग के लिए एक इष्टतम स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। पीएलएम न्यूरॉन का एक निश्चित केंद्र फ्लोरेसेंस रोशनी के तहत किया जाता है ताकि प्रम के अनुचित प्रकाश एक्सपोजर और फोटो ब्लीचिंग को रोका जा सके। छवि अधिग्रहण के लिए हम साइटों से सॉफ्टवेयर भेजने का उपयोग करें।ब्राइटफील्ड चैनल में लाइव इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करके, हम कीड़े के पूंछ क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं और इसे दृश्य क्षेत्र में केंद्र करते हैं। इसके बाद 488 नैनोमीटर एक्सिटेशन लाइट के साथ लाइट इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन का इस्तेमाल करते हुए पीएनएम न्यूरॉन पर फोकस किया जाता है। एक समय-चूक अधिग्रहण के लिए, एक प्रयोगात्मक सेटिंग बनाई जाती है जहां एक्सपोजर समय, समय चूक की अवधि और फ्रेम के बीच अंतराल इमेजिंग के लौकिक कौशल को परिभाषित करता है।मात्रात्मक मापन के लिए ईबीपी धूमकेतु की कुछ फिल्मों का विश्लेषण इमेज जे पर किया जाना है, जो एक ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर है। अधिग्रहीत समय-चूक एक बहु छवि कतरा के रूप में खुलता है, कि एक फिल्म के रूप में पूर्वावलोकन किया जा सकता है । इस विशेष समय-चूक में, धूमकेतु को पीएलएम न्यूरॉन के कोशिका शरीर, पूर्वकाल और पीछे की प्रक्रिया में देखा जा सकता है।कोशिका शरीर से दूर जाने वाले धूमकेतु को प्लस-एंड-आउट के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, और सेल शरीर की ओर बढ़ने वालों को शून्य-अंत-आउट के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। विश्लेषण शुरू करने के लिए एक खंडित रेखा ब्याज के क्षेत्र में तैयार की जाती है, जो इस मामले में पीएलएम न्यूरॉन की आंतरिक प्रक्रिया है। इस लाइन सेगमेंट को छवियों के रिस्लिक समारोह का उपयोग करके एक काय्मोग्राफ में परिवर्तित किया जाता है।एक कायोग्राफ चलती धूमकेतु का प्रतिनिधित्व विकर्ण क्रीज के साथ एक दूरी के समय छवि है। इन निशानों पर सीधी रेखा खंड तैयार किए जा सकते हैं और विश्लेषण मेनू का उपयोग करके माप मापदंडों को सेट किया जा सकता है। इन मापदंडों को एक्सेल जैसे डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में मानक मापने योग्य मात्राओं और इकाइयों में परिवर्तित किया जा सकता है।ट्रेस की चौड़ाई विकास की लंबाई से मेल खाती है। हाईट ग्रोथ अवधि का प्रतिनिधित्व करता है और क्रीज का कोण धूमकेतु की दिशा देता है। माइक्रोट्यूबल्स के सापेक्ष अभिविन्यास को खोजने के लिए इन धूमकेतुओं को प्लस-एंड-आउट और माइनस-एंड-आउट में वर्गीकृत किया जा सकता है।ईबीटीए जीएफपी की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति को विभिन्न सेलुलर संदर्भ में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि नए उत्थान। क्षेत्र रेटिंग अक्षतंतु में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए, अक्षतंतु एक फेमटोसेकंड लेजर का उपयोग करके घायल हो जाता है, जो बड़े पैमाने पर संपाश्र्वक क्षति के कारण अक्षतंतु को ठीक से तोड़ सकता है। चोट के बाद, कीड़े बाद में टिप्पणियों के लिए वरीयता प्राप्त इंजन प्लेटों पर बरामद किया जा सकता है ।पीएलएम न्यूरॉन्स मजबूत दोषमुक्त उत्थान दिखाते हैं, जिसे चोट के छह घंटे बाद देखा जा सकता है। नए अधिकारों को पुनर्जीवित करने के लिए फोटोटॉक्सिसिटी को रोकने के लिए, लाइव इमेजिंग एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप में किया जाता है। पुनर्जीवित एक्सॉन के समय-चूक अधिग्रहण को बाद में धूमकेतु के विश्लेषण के लिए kymographs में परिवर्तित किया जा सकता है।धूमकेतु की दूरी की अवधि और दिशा को माइक्रोट्यूबुले अभिविन्यास और गतिशीलता के संदर्भ में समझा जा सकता है। मेरा महत्वपूर्ण अभिविन्यास और गतिशीलता सेल डिवीजन, माइग्रेशन और सेलुलर वास्तुकला के रखरखाव जैसी सिविल सेलुलर प्रक्रियाओं के प्रमुख निर्धारक हैं। यद्यपि वीवो माप में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता के माप के लिए कई उपकरण उपलब्ध हैं, चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं।ऑटोफ्लोरेसेंस, फोटो विषाक्तता, ओवर एक्सप्रेशन विरूपण साक्ष्य, और चर रिपोर्ट की गई तीव्रता माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता का आकलन करने के लिए, अंत-बाध्यकारी प्रोटीन के लाइव अवलोकन के दौरान सामने आई कुछ कठिनाइयां हैं। निर्वासित डीएनए और कम रोशनी इमेजिंग की कम एकाग्रता के साथ एक एकीकृत ट्रांसजेनिक का उपयोग करके, इस अध्ययन ने इनमें से कुछ चुनौतियों को कम करने के तरीकों को संबोधित किया है । यहां वर्णित इमेजिंग और विश्लेषण मॉड्यूल को अन्य माइक्रोट्यूबुल आधारित संवाददाताओं और प्रोटीन परिवहन की ओर बढ़ाया जा सकता है।यह न केवल सी लालित्य न्यूरॉन्स पर लागू होता है, बल्कि अन्य सेल प्रकारों और मॉडल सिस्टम पर लागू किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

सी. में vivo लेजर Axotomy में एलिगेंस

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

प्रतिगामी फ्लोरोसेंट लेबलिंग पहचाने गए न्यूरॉन्स से लक्षित कोशिकी एकल इकाई रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है<em&gt; विवो में</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

कार्यात्मक न्यूरोइमेजिंग अल्ट्रासोनिक रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन और मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई का उपयोग

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Vivo सी. में neuronal कैल्शियम इमेजिंग में एलिगेंस

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

मस्तिष्क टुकड़ा Biotinylation: एक<em&gt; पूर्व vivo</emवयस्क न्यूरॉन्स में क्षेत्र विशेष के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी करने के लिए उपाय&gt; दृष्टिकोण

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

समकालिक<em&gt; पूर्व vivo</emदो Retinas की&gt; कार्यात्मक परीक्षण से<em&gt; Vivo</em&gt; Electroretinogram सिस्टम

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric व्यवहार में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की कैल्शियम इमेजिंग Caenorhabditis एलिगेंस

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

तैयारी और पूरे सेल पैच दबाना के लिए प्रोटोकॉल Xenopus laevis Tectal ंयूरॉंस की रिकॉर्डिंग

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...