Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Ringraziamo Yishi Jin e Andrew Chisholm per il supporto iniziale e il ceppo utilizzato nello studio. Il ceppo batterico OP50 è stato utilizzato commercialmente dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Ringraziamo anche Dharmendra Puri per la standardizzazione delle procedure sperimentali. Lo studio è finanziato dalla sovvenzione principale del National Brain Research Centre (supportato dal Dipartimento di Biotecnologie, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1 / 504331) a S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1 / 500874) ad A.G.-R e una sovvenzione dal Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) ad A.G.-R.

1. Ceppo reporter: cultura e manutenzione
NOTA: Per misurare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli nei neuroni PLM, abbiamo usato il ceppo worm che esprime EBP-2::GFP sotto il promotore specifico del neurone tattile mec-4 ( allelejuIs338) 18,25,26. Per questo ceppo utilizziamo metodi standard di coltura e manutenzione dei vermi<sup c...

La comprensione della dinamica dei microtubuli è stata un obiettivo chiave nel campo della ricerca citoscheletrica nel corso degli anni. I microtubuli subiscono nucleazione e catastrofe insieme a un processo continuo di instabilità dinamica44,45,46,47. Molte di queste informazioni sono state ottenute attraverso saggi in vitro come le lettura di diffusione della lu...

I neuroni hanno un'architettura elaborata con compartimenti specializzati come dendriti, corpi cellulari, assoni e sinapsi. Il citoscheletro neuronale è costituito dai microtubuli, microfilamenti e neurofilamenti e la loro organizzazione distinta supporta i compartimenti neuronali strutturalmente e funzionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Nel corso degli anni, l'organizzazione dei microtubuli è stata identificata come un determinante chiave della polarità e della funzione neuronale. Mentre i neuroni subiscono un rimodellamento strutturale durante lo sviluppo o la rigenerazione, la dinamica e l'orientamento dei microtubuli determinano l'identità, il trasporto polarizzato, la crescita e lo sviluppo di vari compartimenti neuronali7. È quindi imperativo valutare la dinamica dei microtubuli e l'orientamento in vivo per correlarsi con il processo di rimodellamento neuronale.
I microtubuli sono composti da protofilamenti di eterodimeri di α e β tubulina con estremità più dinamiche e estremità meno relativamente stabili11,12. La scoperta del complesso plus tip e delle proteine leganti l'estremità associate hanno permesso una piattaforma per valutare l'organizzazione dei microtubuli13. Le proteine leganti l'estremità (EBP) si associano transitoriamente alle estremità più crescenti del microtubulo e le loro dinamiche di associazione sono correlate alla crescita dei protofilamenti dei microtubuli14,15. A causa della frequente associazione e dissociazione del complesso plus tip con il microtubulo, la funzione di diffusione puntuale dell'EBP con tag GFP appare come una "cometa" in un film timelapse15,16. Dall'osservazione pionieristica nei neuroni dei mammiferi16,le proteine leganti le estremità marcate con proteine fluorescenti sono state utilizzate per determinare la dinamica dei microtubuli in diversi sistemi modello e tipi di neuroni17,18, 19,20,21,22,23.
Grazie al suo semplice sistema nervoso e al corpo trasparente, C. elegans ha dimostrato di essere un eccellente sistema modello per studiare il rimodellamento neuronale durante lo sviluppo e la rigenerazione in vivo. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando EBP-2::GFP geneticamente codificato, abbiamo ripreso i microtubuli nel neurone PLM, che ci ha permesso di determinare la polarità dei microtubuli in due diversi neuriti di questo neurone24. Questo metodo consente l'osservazione e la quantificazione delle comete EBP come misura della dinamica dei microtubuli in diversi contesti cellulari, ad esempio, i cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l'assotomia possono essere valutati utilizzando il nostro protocollo. Questo test può essere adattato per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari in diversi tipi di cellule e background genetici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

Nei neuroni, l'orientamento dei microtubuli è stato un valutatore chiave per identificare gli assoni che hanno microtubuli e dendriti plus-end che generalmente hanno un orientamento misto. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificati di punte di microtubuli, abbiamo ripreso i microtubuli assonali. I cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l'assotomia possono essere quantificati utilizzando questo protocollo. Questo test è adattabile ad altri neuroni e background genetici per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari.

Come esempio rappresentativo, abbiamo descritto l'osservazione in vivo delle comete EBP nello stato stazionario e gli assoni rigeneranti dei neuroni PLM. I neuroni PLM si trovano nella regione della coda del verme con un lungo processo anteriore che forma una sinapsi e un breve processo posteriore. I neuroni PLM crescono nella direzione anteriore-posteriore vicino all'epidermide e sono responsabili della delicata sensazione di tocco nei vermi. A causa della loro struttura semplificata e della suscettibilità all'imaging ...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

L'obiettivo di questa procedura è valutare l'organizzazione e la dinamica dei microtubuli in vivo. I neuroni sono cellule polarizzate con compartimenti assonali, dendritici e sinaptici distinti, mantenuti dal loro citoscheletro sottostante. I microtubuli formano la maggior parte del citoscheletro neuronale e la dinamica e l'orientamento determinano eventi chiave durante lo sviluppo e la maturazione neuronale.I microtubuli sono composti da eterodimeri alfa e beta tubulinica e sono intrinsecamente polarizzati con estremità più altamente dinamiche e estremità inferiori stabili. Durante la polimerizzazione alle estremità più, un complesso multimolerele di proteine leganti l'estremità, si associa transitoriamente ai protofilamenti e promuove l'assemblaggio di dimeri di tubulina. Questa tecnica ci aiuterà a visualizzare i microtubuli neurali in vivo.Usando questa tecnica, si può determinare l'orientamento e altri parametri dei microtubuli dinamici durante lo sviluppo e la rigenerazione del neurone C.elegans. In genere usiamo questo reporter per visualizzare la dinamica dei microtubuli nel neurone sensoriale. Tuttavia, si può esprimere questo reporter in altri tipi di cellule come muscoli e pelle per visualizzare microtubuli dinamici in queste cellule.Le proteine che legano le estremità etichettate fluorescentmente come EBP a GFP qui, appaiono come comete. La dinamica di queste comete è stata correlata con la crescita concomitante dei microtubuli e un indicatore chiave per misurare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli. Per osservare queste comete in un tipo di cellula specifico, il transgene con DNA di EBP-2 e GFP è espresso sotto un promotore specifico.Per l'espressione nei neuroni PLM, questo transgene è espresso sotto il make for promoter. Questi vermi transgenici possono essere visualizzati al microscopio stereo, con fluorescenza impostata prima dello smistamento o del montaggio. Per il montaggio dei worm per l'imaging delle comete EBP, realizziamo un Argos al 10% in un buffer M9.e posizionare una goccia su un vetrino. Un'altra diapositiva viene utilizzata per premere la goccia in un film che si solidifica in un pad. Usiamo 0,1 micron, perline di polistirene come mezzo di montaggio, alcuni vermi vengono raccolti e ri-sospesi nella soluzione di perline.Una scivolata di copertura viene bracconata per immobilizzare i vermi e presa per l'imaging. Quelli montati possono essere ripresi su qualsiasi microscopio a fluorescenza con una telecamera per l'imaging ad alta risoluzione. La configurazione è dotata di un'unità disco rotante per un'acquisizione più rapida e una riduzione dello sbiancamento fotografico e della fototossicità.La diapositiva viene mantenuta sul palco e il campo dei vermi è focalizzato e centrato utilizzando l'illuminazione a campo luminoso. Un obiettivo a basso ingrandimento come 5X o 10X può essere utilizzato per questo scopo. I worm possono essere rimessi a fuoco con un obiettivo di ingrandimento elevato come 63X utilizzando la stessa illuminazione.Questo obiettivo fornisce una risoluzione spaziale ottimale per l'imaging delle comete. Un centraggio fisso del neurone PLM viene eseguito sotto l'illuminazione a fluorescenza per prevenire l'eccessiva esposizione alla luce e lo sbiancamento fotografico del prum. Per l'acquisizione delle immagini utilizziamo software di invio fuori siti.Utilizzando la configurazione di imaging dal vivo nel canale brightfield, focalizzamo la regione di coda del worm e la centriamo nel campo visivo. Questo è seguito dalla messa a fuoco del neurone PNM utilizzando la configurazione di imaging della luce con luce di eccitazione a 488 nanometri. Per un'acquisizione time-lapse, viene creata un'impostazione sperimentale in cui il tempo di esposizione, la durata del time lapse e l'intervallo tra i fotogrammi definiscono le abilità temporali dell'imaging.Per le misurazioni quantitative alcuni filmati di comete EBP devono essere analizzati su Image J, che è un software open source. Il time-lapse acquisito si apre come un filone multi-immagine, che può essere visualizzato in anteprima come filmato. In questo particolare lasso di tempo, le comete possono essere viste nel corpo cellulare, nel processo anteriore e posteriore del neurone PLM.Le comete che si allontanano dal corpo cellulare sono classificate come plus-end-out, e quelle che si muovono verso il corpo cellulare sono classificate come minus-end-out. Per iniziare l'analisi viene tracciata una linea segmentata sulla regione di interesse, che in questo caso è il processo interno del neurone PLM. Questo segmento di linea viene convertito in un kymograph utilizzando la funzione di reslice delle immagini.Un kymograph è un'immagine temporale a distanza con pieghe diagonali che rappresentano le comete in movimento. Su queste tracce è possibile disegnare segmenti rettilinei e impostare parametri di misurazione utilizzando il menu analizza. Questi parametri possono essere convertiti in quantità e unità misurabili standard nel programma di analisi dei dati come Excel.La larghezza della traccia corrisponde alla lunghezza di crescita. L'altezza rappresenta la durata della crescita e l'angolo della piega dà la direzione delle comete. Queste comete possono essere ulteriormente classificate in plus-end-out e minus-end-out, per trovare l'orientamento relativo dei microtubuli.L'espressione transgenica di EBTA GFP può essere adattata per osservare la dinamica dei microtubuli in vari contesti cellulari, come la nuova rigenerazione. Per osservare la dinamica dei microtubuli negli assoni di valutazione della regione, l'assone viene ferito utilizzando un laser a femtosecondi, che può recise l'assone con precisione senza causare enormi danni collaterali. Dopo l'infortunio, i vermi possono essere recuperati su piastre del motore seminate per osservazioni successive.I neuroni PLM mostrano una robusta rigenerazione esonero, che può essere osservata già sei ore dopo l'infortunio. Per prevenire la fototossicità per rigenerare nuovi diritti, l'imaging dal vivo viene eseguito in un microscopio a disco rotante. Le acquisizioni time-lapse degli assoni rigeneranti possono essere successivamente convertite in chimografi per l'analisi delle comete.La durata della distanza e la direzione delle comete possono quindi essere interpretate in termini di orientamento e dinamica dei microtubuli. Il mio orientamento critico e le mie dinamiche sono determinanti chiave dei processi cellulari civili come la divisione cellulare, la migrazione e il mantenimento dell'architettura cellulare. Sebbene ci siano molti strumenti disponibili per la misurazione della dinamica dei microtubuli, la misurazione in vivo può essere impegnativa.L'autofiorescenza, la fototossicità, l'artefatto di sovraespressione e le intensità variabili riportate sono alcune delle difficoltà incontrate durante l'osservazione dal vivo delle proteine leganti l'estremità, per valutare la dinamica dei microtubuli. Utilizzando un transgenico integrato con bassa concentrazione di DNA deportato e immagini a bassa illuminazione, questo studio ha affrontato metodi per mitigare alcune di queste sfide. I moduli di imaging e analisi qui descritti possono essere estesi ad altri reporter basati su microtubuli e al trasporto di proteine.Questo non è applicabile solo ai neuroni C.elegance, ma può essere applicato ad altri tipi di cellule e sistemi modello.

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