Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

私たちは、初期のサポートと研究で使用される緊張のためにイーシ・ジンとアンドリュー・チザムに感謝します。細菌株OP50は、研究インフラプログラムのNIH事務所(P40 OD010440)が資金を提供するカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)から商業的に利用されました。また、実験手順の標準化に対するダルメンドラ・プリに感謝します。この研究は、国立脳研究センター(インドのバイオテクノロジー省、インド政府の支援)、DBT/ウェルカム・トラスト・インディア・アライアンス早期キャリア・グラント(グラント#IA/E/18/1/504331)のS.D.、ウェルカム・トラストDBTインド同盟中間助成金(グラント#IA/I/13/1/500874)のコアグラントによって資金提供されています。 CRG/2019/002194) から A.G.-R へ。

1. レポーター株:文化とメンテナンス
注:PLMニューロンの微小管のダイナミクスと向きを測定するために、我々はEBP-2を発現するワーム株を使用しました::GFPはタッチニューロン特異的プロモーター mec-4(juIs338アレーレ)18、25、26の下で。私たちは、この株<sup ...

微小管ダイナミクスを理解することは、長年にわたって細胞骨格研究の分野で重要な焦点となっています。微小管は、動的不安定性44、45、46、47の連続的なプロセスと共に核形成および大惨事を起こす。この情報の多くは、遊離対重合チューブリンの光散乱読み出し、蛍光チ...

ニューロンは、樹状突起、細胞体、軸索、シナプスなどの特殊なコンパートメントを備えた精巧なアーキテクチャを持っています。ニューロン細胞骨格は、微小管、マイクロフィラメント、および神経フィラメントと、その明確な組織が、神経区画を構造的および機能的に支持する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 .長年にわたり、微小管組織は、神経極性および機能の重要な決定要因として同定されてきた。ニューロンが開発中または再生中に構造リモデリングを受けるにつれて、微小管のダイナミクスと配向は、様々なニューロンコンパートメントのアイデンティティ、偏光輸送、成長、および発達を決定する。したがって、ニューロンリモデリングプロセスと相関させるために、生体内での微小管ダイナミクスおよび向きを評価することが不可欠である。
微小管は、αおよびβのtubulinヘテロ二量体の原始フィラメントで構成され、動的なプラスエンドと比較的安定したマイナス末端11,12を有する。プラス先端複合体および関連するエンド結合タンパク質の発見により、プラットフォームは微小管組織13を評価することができました。エンド結合タンパク質(EBP)は、微小管の成長プラス末端と一過性に関連付け、それらの関連ダイナミクスは、微小管原線維14、15の成長と相関している。微小管とのプラス先端複合体の頻繁な関連付けと解離のために、GFPタグ付きEBPの点広がり関数は、タイムラプスムービー15,16において「彗星」として現れる。哺乳類ニューロン16における先駆的な観察以来、蛍光タンパク質でタグ付けされた末端結合タンパク質は、異なるモデル系およびニューロンタイプ17、18、19、20、21、22、23の間で微小管ダイナミクスを決定するために使用されてきた。
その単純な神経系と透明な体のために 、C.エレガンス は 、開発中および生体内の再生中にニューロンのリモデリングを研究するための優れたモデルシステムであることが証明されています。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。遺伝的にコード化されたEBP-2:::GFPを用いて、PLMニューロン内の微小管を画像化し、このニューロン24の2つの異なる神経突起中の微小管の極性を決定することができた。この方法は、異なる細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスの尺度としてEBP彗星の観察および定量化を可能にする、例えば、奇方解術後に軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化は、我々のプロトコルを用いて評価することができる。このアッセイは、多様な細胞タイプおよび遺伝的背景における様々な細胞プロセスにおける微小管動力学の調節を調べることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

ニューロンでは、微小管配向は、一般的に配向が混在するプラスエンドアウト微小管と樹状突起を有する軸索を同定するための重要な査定者であった。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。微小管先端の遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いて、軸索微小管を画像化した。このプロトコルを使用して、奇数に続いて軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化を定量化することができる。このアッセイは、様々な細胞プロセスにおける微小管ダイナミクスの調節を調査するために、他のニューロンおよび遺伝的背景に適応可能である。

代表的な例として、PLMニューロンの定常状態および再生軸索におけるEBP彗星のインビボ観察について説明した。PLMニューロンは、シナプスと短い後工程を形成する長い前工程を有するワームの尾領域に位置する。PLMニューロンは表皮に近い前部後方向に成長し、ワームの穏やかな接触感覚を担う。PLMニューロンは、その構造が単純化され、イメージングとマイクロサージャリーに対する無分?...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。 我々は、C.エレガンスの後方微小管(PLM)ニューロンにおける動的微小管の標識、画像化、および分析の方法を説明した。

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

この手順の目的は、生体内の微小管組織とダイナミクスを評価することです。ニューロンは、軸索、樹状、シナプスコンパートメントを持つ偏光細胞であり、その根底にある細胞骨格によって維持されます。微小管はニューロン細胞骨格の大部分を形成し、ダイナミクスと向きは神経細胞の発達と成熟の間に主要な事象を決定する。微小管は、アルファおよびベータチューブリンヘテロダイマーで構成され、本質的に非常にダイナミックなプラスエンドと安定したマイナスエンドで二極化しています。プラスエンドでの重合の間、エンド結合タンパク質の多分子複合体は、プロトフィラメントと一過性に関連付け、チューブリンダイマーの組み立てを促進する。この技術は、生体内の神経微小管を可視化するのに役立ちます。この技術を使用して、C.elegansニューロンの発達および再生中に動的微小管の向きおよび他のパラメータを決定することができる。我々は通常、このレポーターを使用して、感覚ニューロンの微小管ダイナミクスを視覚化する。しかし、筋肉や皮膚などの他の細胞型でこのレポーターを発現させ、これらの細胞内の動的微小管を可視化することができます。ここで蛍光標識されたエンド結合タンパク質は、ここでEBPをGFPにし、彗星として現れる。これらの彗星のダイナミクスは、微小管の併発成長と相関しており、微小管のダイナミクスと向きを測定するための重要な指標である。特定の細胞型でこれらの彗星を観察するために、EBP-2およびGFPのDNAを有するトランスジーンは、特定のプロモーター下で発現される。PLMニューロンにおける発現に関しては、このトランスジーンはプロモーターのmakeの下で発現される。これらのトランスジェニックワームは、選別または取り付け前に蛍光を設定して、ステレオ顕微鏡で見ることができます。EBP彗星をイメージングするためのワームを取り付けるために、M9バッファに10%アルゴスを作ります。とガラススライドにドロップを置きます。別のスライドは、パッドに固めるフィルムにドロップを押すために使用されます。我々は0.1ミクロン、ポリスチレンビーズを取り付け媒体として使用し、いくつかのワームが選ばれ、ビーズ溶液に再懸濁される。カバースリップは、ワームを固定するために密猟され、イメージングのために撮影されます。取り付けられたものは、高解像度イメージングのためのカメラを使用して、任意の蛍光顕微鏡で画像化することができます。セットアップはより速く集録し、減らされた写真の漂白および光毒性のための回転ディスク装置が装備されている。スライドはステージ上に保持され、ワームのフィールドは、明視野照明を使用して集中し、中央に配置されています。5Xや10Xのような低倍率の目的は、この目的のために使用することができます。同じ照明を使用して63Xのような高倍率の目的でワームを再集重することができます。この目的は彗星のイメージ投射に最適な空間分解能を提供する。PLMニューロンの固定センタリングは、過度の光暴露とprumの写真の漂白を防ぐために蛍光照明の下で行われます。画像取得のために、我々はサイトからソフトウェアを送信を使用します。明視野チャネルでライブイメージング構成を使用して、我々は、ワームの尾領域をフォーカスし、ビューフィールドにそれを中心にします。その後、488ナノメートルの励起光を用いた光イメージング構成を用いてPNMニューロンを集光する。タイムラプス獲得の場合、露光時間、時間経過時間、フレーム間の間隔がイメージングの時間的スキルを定義する実験的な設定を作成します。定量測定では、EBP彗星の一部の映画をオープンソースソフトウェアであるイメージJで分析する必要があります。取得したタイムラプスは、映画としてプレビューできるマルチイメージストランドとして開きます。この特定のタイムラプスでは、彗星は、細胞体、前および後工程のPLMニューロンに見ることができる。細胞体から離れる彗星はプラスエンドアウトに分類され、細胞体に向かって移動する彗星はマイナスエンドアウトに分類されます。分析を開始するには、セグメント化された線が対象領域(この場合はPLMニューロンの内部プロセス)に引かれます。この線分は画像の再スライス機能を使用して、キモグラフに変換されます。キモグラフは移動する彗星を表す対角線折り目を持つ距離時間画像です。これらのトレースに直線セグメントを描画し、分析メニューを使用して測定パラメータを設定できます。これらのパラメータは、Excel などのデータ分析プログラムで、標準の測定可能な数量と単位に変換できます。トレースの幅は、拡張長に対応します。高さは成長期間を表し、折り目の角度は彗星の方向を示す。これらの彗星は、さらにプラスエンドアウトとマイナスエンドアウトに分類され、微小管の相対的な向きを見つけることができます。EBTA GFPのトランスジェニック発現は、新しい再生などの様々な細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスを観察するように適応することができる。領域評価軸索の微小管ダイナミクスを観察するために、軸索はフェムト秒レーザーを使用して負傷し、大規模な担保損傷を引き起こすことなく軸索を正確に切断することができます。損傷後、ワームは後の観察のためにシードされたエンジンプレートに回収することができる。PLMニューロンは、損傷後6時間で早くも観察することができる堅牢なエキセネリー再生を示す。新たな権利を再生する光毒性を防ぐために、生画像化は回転ディスク顕微鏡で行われる。再生軸索のタイムラプス獲得は、後で彗星の分析のためにカイモグラフに変換することができます。彗星の距離の長さと方向は、微小管の向きとダイナミクスの観点から解釈することができます。私の重要な方向性とダイナミクスは、細胞分裂、移動、細胞アーキテクチャの維持などの民間細胞プロセスの重要な決定者です。生体内での微小管ダイナミクスの測定には多くのツールが利用できますが、難しい場合があります。自己花序、光毒性、過発現アーティファクト、および可変報告強度は、エンド結合タンパク質の実観察中に遭遇する困難の一部であり、微小管ダイナミクスを評価する。この研究は、低濃度のDNAおよび低照度イメージングを伴う統合トランスジェニックを使用して、これらの課題のいくつかを軽減する方法に取り組んできた。ここで説明するイメージングおよび分析モジュールは、他の微小管ベースのレポーターおよびタンパク質輸送に向けて拡張することができる。これは、C.エレガンスニューロンに適用されるだけでなく、他の細胞タイプやモデルシステムにも適用できます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...