Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Vi takker Yishi Jin og Andrew Chisholm for den første støtten og belastningen som ble brukt i studien. Bakteriestammen OP50 ble kommersielt benyttet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi takker også Dharmendra Puri for standardiseringen av eksperimentelle prosedyrer. Studien er finansiert av kjernestipendet til National Brain Research Centre (støttet av Institutt for bioteknologi, Govt. of India), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1/504331) til S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1/500874) til A.G.-R og et stipend fra Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) til A.G.-R.

1. Reporter belastning: Kultur og vedlikehold
MERK: For å måle mikrotubuldynamikken og orienteringen i PLM-nevronene brukte vi ormstammen som uttrykte EBP-2::GFP under berøring nevronspesifikk promotor mec-4 (juIs338 allele)18,25,26. Vi bruker standard ormkultur og vedlikeholdsmetoder for denne stammen27.
<ol>...

Å forstå mikrotubuldynamikken har vært et sentralt fokus innen cytoskeletal forskning gjennom årene. Mikrotubuler gjennomgår kjernedannelse og katastrofe sammen med en kontinuerlig prosess med dynamisk ustabilitet44,45,46,47. Mye av denne informasjonen er oppnådd gjennom in vitro-analyser som lysspredningsavlesninger av fri vs polymerisert tubulin, mikrotubul ...

Nevroner har en forseggjort arkitektur med spesialiserte rom som dendritter, cellelegemer, axoner og synapser. Den nevronale cytoskjelettet består av mikrotubuler, mikrofilamenter og nevrofilamenter, og deres distinkte organisasjon støtter nevronrommene strukturelt og funksjonelt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Gjennom årene har mikrotubul organisasjon blitt identifisert som en nøkkeldeterminant for nevronal polaritet og funksjon. Når nevroner gjennomgår strukturell ombygging under utvikling eller regenerering, bestemmer mikrotubuldynamikken og orienteringen identiteten, polarisert transport, vekst og utvikling av ulike nevronrom7. Det er derfor viktig å vurdere mikrotubuldynamikken og orienteringsinvoen for å korrelere med den nevronale ombyggingsprosessen.
Mikrotubuler består av protofilaments av α og β Tubulin heterodimers med dynamiske pluss ender og relativt stabile minus ender11,12. Oppdagelsen av plussspisskomplekset og tilhørende sluttbindingsproteiner har gjort det mulig for en plattform å vurdere mikrotubuleorganisasjonen13. Sluttbindingsproteiner (EBP) forbigående forbinder med de voksende pluss endene av mikrotubulen, og deres assosiasjonsdynamikk er korrelert med veksten av mikrotubule-protofilamentene14,15. På grunn av hyppig assosiasjon og dissosiasjon av plussspisskompleks med mikrotubulen, vises punktspredningsfunksjonen til GFP-merket EBP som en "komet" i en timelapse-film15,16. Siden den banebrytende observasjonen i pattedyr nevroner16, sluttbinding proteiner merket med fluorescerende proteiner har blitt brukt til å bestemme mikrotubule dynamikken på tvers av ulike modellsystemer og neuron typer17,18,19,20,21,22,23.
På grunn av sitt enkle nervesystem og gjennomsiktige kropp har C. elegans vist seg å være et utmerket modellsystem for å studere nevronal ombygging under utvikling og regenerering in vivo. Her beskriver vi metoder for å merke, bilde og analysere mikrotubuldynamikken og veksten under utvikling og regenerering av berøringsnevroner i C. elegans. Ved hjelp av genetisk kodet EBP-2::GFP, avbildet vi mikrotubulene i PLM-nevronen, noe som tillot oss å bestemme mikrotubulens polaritet i to forskjellige neuritter i denne nevron24. Denne metoden tillater observasjon og kvantifisering av EBP-kometene som et mål på mikrotubuldynamikk i forskjellige cellulære sammenhenger, for eksempel kan de lokale endringene i mikrotubuladferd som initierer axonregenerering etter axotomi vurderes ved hjelp av vår protokoll. Denne analysen kan tilpasses for å undersøke reguleringen av mikrotubuldynamikk i ulike cellulære prosesser i ulike celletyper og genetisk bakgrunn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

I nevroner har mikrotubul orientering vært en viktig takstmann for å identifisere axoner som har pluss-end ut mikrotubuler og dendritter som generelt har blandet orientering. Her beskriver vi metoder for å merke, bilde og analysere mikrotubuldynamikken og veksten under utvikling og regenerering av berøringsnevroner i C. elegans. Ved hjelp av genetisk kodede fluorescerende reportere av mikrotubule tips, avbildet vi de axonale mikrotubulene. De lokale endringene i mikrotubul oppførsel som starter axon regenerering etter axotomi kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen. Denne analysen er tilpasningsdyktig til andre nevroner og genetisk bakgrunn for å undersøke reguleringen av mikrotubuldynamikk i ulike cellulære prosesser.

Som et representativt eksempel har vi beskrevet in vivo observasjon av EBP-kometene i steady-state og regenererende axoner av PLM-nevronene. PLM-nevroner ligger i haleområdet av ormen med en lang fremre prosess som danner en synapse og en kort bakre prosess. PLM-nevroner vokser i den fremre bakre retningen nær epidermis og er ansvarlige for den milde berøringsfølelsen i ormene. På grunn av deres forenklede struktur, og egnethet til avbildning og mikrokirurgi, har PLM-nevroner blitt grundig undersøkt for deres mikro...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

En protokoll for avbildning av de dynamiske mikrotubulene in vivo ved hjelp av fluorescerende merket End bindingsprotein har blitt presentert. Vi beskrev metodene for å merke, bilde og analysere de dynamiske mikrotubulene i Posterior lateral microtubule (PLM) neuron av C. elegans.

In vivo Vurdering av mikrotubul dynamikk og orientering i Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Målet med denne prosedyren er å vurdere mikrotubule-organisasjonen og dynamikken in vivo. Nevroner er polariserte celler med distinkte axonale, dendritiske og synaptiske rom, vedlikeholdt av deres underliggende cytoskjelett. Mikrotubuler danner flertallet av nevronal cytoskjelett, og dynamikken og orienteringen bestemmer viktige hendelser under nevronutvikling og modning.Mikrotubuler består av alfa- og beta tubulin-heteroodimere, og polariseres iboende med svært dynamiske pluss-ender og stabile minus-ender. Under polymerisering i pluss-endene, et multimolekylært kompleks av end-bindende proteiner, forbigående forbinder med protofilaments og fremmer montering av tubulin dimers. Denne teknikken vil hjelpe oss med å visualisere nevrale mikrotubuler in vivo.Ved hjelp av denne teknikken kan man bestemme orienteringen og andre parametere for dynamiske mikrotubuler under utvikling og regenerering av C.elegans neuron. Vi bruker vanligvis denne reporteren til å visualisere mikrotubuldynamikk i sensorisk nevron. Imidlertid kan man uttrykke denne reporteren i andre celletyper som muskler og hud for å visualisere dynamiske mikrotubuler i disse cellene.Fluorescerende merkede endebindende proteiner som KBP til GFP her, vises som kometer. Dynamikken i disse kometene har vært korrelert med samtidig vekst av mikrotubulene, og en nøkkelindikator for å måle mikrotubuldynamikk og orientering. For å observere disse kometene i en bestemt celletype, uttrykkes transgene med DNA fra EBP-2 og GFP under en bestemt promotor.For uttrykk i PLM-nevronene uttrykkes denne transgene under merke for promotor. Disse transgene ormene kan sees under et stereomikroskop, med fluorescens satt opp før sortering eller montering. For montering av ormer for avbildning av EBP-kometer, lager vi en 10% Argos i M9 buffer.og legg en dråpe på en glasssklie. Et annet lysbilde brukes til å trykke dråpen inn i en film som størkner inn i en pute. Vi bruker 0,1 mikron, polystyrenperler som monteringsmedium, noen ormer plukkes og suspenderes i perleløsningen.En dekkslipp er poached for å immobilisere ormene og tatt for avbildning. De monterte kan avbildes på et hvilket som helst fluorescensmikroskop med et kamera for høyoppløselig bildebehandling. Oppsettet er utstyrt med en spinnende diskenhet for raskere oppkjøp og redusert fotobleking og fototoksisitet.Lysbildet holdes på scenen og ormenes felt er fokusert og sentrert ved hjelp av lysfeltbelysningen. Et lavt forstørrelsesmål som 5X eller 10X kan brukes til dette formålet. Ormene kan fokuseres på nytt med et høyt forstørrelsesmål som 63X ved hjelp av samme belysning.Dette målet gir en optimal romlig oppløsning for avbildning av kometene. En fast sentrering av PLM-nevronen gjøres under fluorescensbelysningen for å forhindre unødig lyseksponering og fotobleking av prum. For bildeanskaffelsen bruker vi send programvare fra nettsteder.Ved hjelp av live bildebehandlingskonfigurasjon i brightfield-kanalen fokuserer vi haleområdet til ormen og sentrerer den i visningsfeltet. Dette etterfølges av fokus på PNM-nevronen ved hjelp av lysavbildningskonfigurasjon med 488 nanometer eksitasjonslys. For et tidsforløpanskaffelse opprettes en eksperimentell innstilling der eksponeringstid, varighet av tidsforløpet og intervallet mellom rammene definerer tidsmessige ferdigheter i avbildning.For kvantitative målinger skal noen filmer av EBP-kometer analyseres på Image J, som er en åpen kildekode-programvare. Den oppkjøpte tidsforløpet åpnes som en tråd med flere bilder, som kan forhåndsvises som en film. I denne spesielle tidsforløpet kan kometer ses i cellekroppen, fremre og bakre prosess av PLM-nevronen.Kometene som beveger seg bort fra cellekroppen er klassifisert som plus-end-out, og de som beveger seg mot cellekroppen er klassifisert som minus-end-out. For å starte analysen trekkes en segmentert linje over interesseområdet, som i dette tilfellet er den indre prosessen til PLM-nevronen. Dette linjesegmentet konverteres til en kymografi ved hjelp av reslice-funksjonen til bilder.En kymografi er et avstandstidsbilde med diagonale krøller som representerer de bevegelige kometene. Rette linjesegmenter kan tegnes på disse sporene, og måleparametere kan angis ved hjelp av analysemenyen. Disse parameterne kan konverteres til standard målbare antall og enheter i dataanalyseprogrammet som Excel.Bredden på sporet tilsvarer vekstlengden. Høyden representerer vekstvarighet, og vinkelen på brettet gir kometenes retning. Disse kometene kan videre klassifiseres i plus-end-out og minus-end-out, for å finne den relative orienteringen av mikrotubuler.Transgent uttrykk for EBTA GFP kan tilpasses for å observere mikrotubuldynamikk i ulike cellulære sammenhenger, for eksempel ny regenerering. For å observere mikrotubuldynamikken i regionen som vurderer axoner, blir axon skadet ved hjelp av en femtosecond laser, noe som kan kutte axonen nøyaktig uten å forårsake massiv sikkerhetsskade. Etter skaden kan ormene gjenvinnes på frømotorplater for senere observasjoner.PLM nevroner viser robust exoneree regenerering, som kan observeres så tidlig som seks timer etter skade. For å forhindre fototoksisitet for å regenerere nye rettigheter, utføres levende bildebehandling i et spinnende diskmikroskop. Tidsforløp oppkjøp av regenererende aksoner kan senere konverteres til kymografier for analyse av kometer.Kometenes avstandsvarighet og retning kan deretter tolkes når det gjelder mikrotubul orientering og dynamikk. Min kritiske orientering og dynamikk er sentrale beregninger av sivile cellulære prosesser som celledeling, migrasjon og vedlikehold av cellulær arkitektur. Selv om det er mange verktøy tilgjengelig for måling av mikrotubuldynamikk i vivo-måling, kan det være utfordrende.Autoflorescence, fototoksisitet, over uttrykksartefakt og variable rapporterte intensiteter er noen av vanskelighetene som oppstår under live observasjon av sluttbindende proteiner, for å vurdere mikrotubuldynamikken. Ved å bruke en integrert transgen med lav konsentrasjon av deportert DNA og lav belysningsavbildning, har denne studien tatt for seg metoder for å redusere noen av disse utfordringene. Bilde- og analysemodulene som er beskrevet her, kan utvides mot andre mikrotubulebaserte reportere og proteintransport.Dette gjelder ikke bare C.elegance nevroner, men kan brukes på andre celletyper og modellsystemer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Merking Tillater målrettet Ekstracellulær Single-enhet Opptak fra Identifiserte Nerveceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric kalsium avbilding av individuelle Neurons i oppfører seg Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Forberedelser og protokoller for hele cellen Patch klemme opptak i Xenopus laevis Tectal nerveceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk merking av pyramidale nevroner i hjerneskiver og i primær cellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...