Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Agradecemos a Yishi Jin e Andrew Chisholm pelo apoio inicial e pela tensão usada no estudo. A cepa bacteriana OP50 foi comercializada do Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Agradecemos também a Dharmendra Puri pela padronização dos procedimentos experimentais. O estudo é financiado pela bolsa central do Centro Nacional de Pesquisa Cerebral (apoiado pelo Departamento de Biotecnologia, Govt. of India), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) para S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) para A.G.-R e uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB: CRG/2019/002194) para A.G.-R.

1. Tensão repórter: Cultura e manutenção
NOTA: Para medir a dinâmica e orientação do microtúbulo nos neurônios PLM, utilizou-se a cepa de verme expressando EBP-2::GFP sob o neurônio de toque promotor específico mec-4 (juIs338 alelo)18,25,26. Usamos a cultura padrão de vermes e métodos de manutenção para esta cepa<sup class="x...

A compreensão da dinâmica dos microtúbulos tem sido um foco fundamental no campo da pesquisa citoesquelletal ao longo dos anos. Microtúbulos sofrem nucleação e catástrofe, juntamente com um processo contínuo de instabilidade dinâmica44,45,46,47. Grande parte dessas informações foi obtida através de ensaios in vitro, como leituras de dispersão de luz de ...

Os neurônios possuem uma arquitetura elaborada com compartimentos especializados como dendritos, corpos celulares, axônios e sinapses. O citoesqueleto neuronal é constituído dos microtúbulos, microfilamentos e neurofilamentos e sua organização distinta suporta os compartimentos neuronais estrutural e funcionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ao longo dos anos, a organização dos microtúbulos foi identificada como um determinante chave da polaridade e função neuronal. À medida que os neurônios passam por remodelação estrutural durante o desenvolvimento ou regeneração, a dinâmica e orientação do microtúbulo determinam a identidade, o transporte polarizado, o crescimento e o desenvolvimento de vários compartimentos neuronais7. É, portanto, imperativo avaliar a dinâmica e orientação do microtúbulo in vivo para se correlacionar com o processo de remodelação neuronal.
Microtúbulos são compostos de perfis de α e β heterodimers tubulin com extremidades dinâmicas mais e extremidades relativamente estáveis menos11,12. A descoberta das proteínas de ligação final do complexo plus tip e associadas permitiu que uma plataforma avaliasse a organização dos microtúbulos13. As proteínas de ligação final (EBP) associam-se transitoriamente com as extremidades crescentes mais do microtúbulo e sua dinâmica de associação estão correlacionadas com o crescimento dos perfis de microtúbulos14,15. Devido à frequente associação e dissociação do complexo de pontas plus com o microtúbulo, a função de propagação de ponto do EBP marcado por GFP aparece como um "cometa" em um filme timelapse15,16. Desde a observação pioneira nos neurônios mamíferos16, proteínas de ligação final marcadas com proteínas fluorescentes têm sido utilizadas para determinar a dinâmica dos microtúbulos em diferentes sistemas modelo e tipos de neurônios17,18,19,20,21,22,23.
Devido ao seu simples sistema nervoso e corpo transparente, C. elegans provou ser um excelente sistema modelo para estudar a remodelagem neuronal durante o desenvolvimento e regeneração in vivo. Aqui descrevemos métodos para rotular, imagem e analisar a dinâmica e crescimento de microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração de neurônios sensíveis ao toque em C. elegans. Usando EBP-2::GFP geneticamente codificado, nós imagemmos os microtúbulos no neurônio PLM, o que nos permitiu determinar a polaridade dos microtúbulos em dois neurites diferentes deste neurônio24. Este método permite a observação e quantificação dos cometas EBP como medida da dinâmica dos microtúbulos em diferentes contextos celulares, por exemplo, as mudanças locais no comportamento dos microtúbulos que iniciam a regeneração do axônio após a axotomia podem ser avaliadas usando nosso protocolo. Este ensaio pode ser adaptado para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos em diversos processos celulares em diversos tipos celulares e origens genéticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

Nos neurônios, a orientação dos microtúbulos tem sido um dos principais assessores para identificar axônios que têm microtúbulos e dendritos que geralmente têm orientação mista. Aqui descrevemos métodos para rotular, imagem e analisar a dinâmica e crescimento de microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração de neurônios sensíveis ao toque em C. elegans. Usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados de pontas de microtúbulos, nós imagemmos os microtúbulos axonais. As mudanças locais no comportamento dos microtúbulos que iniciam a regeneração do axônio após a axotomia podem ser quantificadas usando este protocolo. Este ensaio é adaptável a outros neurônios e origens genéticas para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos em vários processos celulares.

Como exemplo representativo, descrevemos a observação in vivo dos cometas EBP nos axônios de estado estável e regeneradores dos neurônios PLM. Os neurônios PLM estão localizados na região da cauda do verme com um longo processo anterior que forma uma sinapse e um processo posterior curto. Os neurônios PLM crescem na direção anterior-posterior perto da epiderme e são responsáveis pela sensação de toque suave nos vermes. Devido à sua estrutura simplificada, e à comodidade à imagem e à microcirurgia, os n...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

O objetivo deste procedimento é avaliar a organização e dinâmica do microtúbulo in vivo. Os neurônios são células polarizadas com compartimentos axonanos, dendráticos e sinápticos distintos, mantidos por seu citoesqueleto subjacente. Microtúbulos formam a maioria do citoesqueleto neuronal, e a dinâmica e orientação determinam eventos-chave durante o desenvolvimento neuronal e a maturação.Os microtúbulos são compostos por heterodimers alfa e beta tubulin, e são inerentemente polarizados com plus-ends altamente dinâmicos e pontas-negativos estáveis. Durante a polimerização nos plus-ends, um complexo multi-molecular de proteínas de ligação final, associam-se transitoriamente com os perfis e promovem a montagem de dimers de tubulina. Essa técnica nos ajudará a visualizar microtúbulos neurais in vivo.Usando essa técnica, pode-se determinar a orientação e outros parâmetros de microtúbulos dinâmicos durante o desenvolvimento e regeneração do neurônio C.elegans. Normalmente usamos este repórter para visualizar a dinâmica dos microtúbulos no neurônio sensorial. No entanto, pode-se expressar este repórter em outros tipos de células, como músculos e pele para visualizar microtúbulos dinâmicos nessas células.Proteínas de ligação final fluorescentes como EBP para GFP aqui, aparecem como cometas. A dinâmica desses cometas tem sido correlacionada com o crescimento concomitante dos microtúbulos, e um indicador-chave para medir a dinâmica e orientação dos microtúbulos. A fim de observar esses cometas em um tipo celular específico, transgene com DNA de EBP-2 e GFP são expressos sob um promotor específico.Para a expressão nos neurônios PLM, este transgene é expresso sob a responsabilidade de promotor. Esses vermes transgênicos podem ser vistos sob um microscópio estéreo, com fluorescência configurada antes de classificar ou montar. Para a montagem dos worms para imagens de cometas EBP, fazemos um Buffer 10% Argos em M9 buffer.e coloque uma gota em um escorregador de vidro. Outro slide é usado para pressionar a queda em um filme que se solidifica em um bloco. Usamos 0,1 mínccro, contas de poliestireno como meio de montagem, alguns vermes são colhidos e reinsuidos na solução de contas.Um deslizamento de cobertura é caçado para imobilizar os vermes e levado para a imagem. Os montados podem ser filmados em qualquer microscópio de fluorescência com uma câmera para imagens de alta resolução. A configuração é equipada com uma unidade de disco giratório para uma aquisição mais rápida e branqueamento de fotos reduzido e toxicidade fotográfica.O slide é mantido no palco e o campo de vermes é focado e centrado usando a iluminação de campo brilhante. Um objetivo de baixa ampliação como 5X ou 10X pode ser usado para este fim. Os worms podem ser re-focados em um objetivo de alta ampliação como 63X usando a mesma iluminação.Este objetivo fornece uma resolução espacial ideal para a imagem dos cometas. Um centro fixo do neurônio PLM é feito sob a iluminação da fluorescência para evitar exposição indevida à luz e branqueamento fotográfico do prum. Para a aquisição de imagens usamos enviar software fora de sites.Usando a configuração de imagem ao vivo no canal brightfield, focamos a região da cauda do worm e centralizamos-na no campo de visão. Isso é seguido pelo foco do neurônio PNM usando configuração de imagem de luz com luz de excitação de 488 nanômetros. Para uma aquisição de lapso de tempo, uma configuração experimental é criada onde o tempo de exposição, a duração do lapso de tempo e o intervalo entre os quadros definem as habilidades temporais da imagem.Para medições quantitativas alguns filmes de cometas EBP devem ser analisados na Imagem J, que é um software de código aberto. O lapso de tempo adquirido abre como uma vertente de várias imagens, que pode ser visualizada como um filme. Neste lapso de tempo em particular, os cometas podem ser vistos no corpo celular, processo anterior e posterior do neurônio PLM.Os cometas que se afastam do corpo celular são classificados como plus-end-out, e aqueles que se movem em direção ao corpo celular são classificados como menos-end-out. Para iniciar a análise é traçada uma linha segmentada sobre a região de interesse, que neste caso é o processo interno do neurônio PLM. Este segmento de linha é convertido em um kymograph usando a função de reslice de imagens.Um kymograph é uma imagem de tempo de distância com vincos diagonais representando os cometas em movimento. Segmentos em linha reta podem ser desenhados nesses traços e parâmetros de medição podem ser definidos usando o menu analisar. Esses parâmetros podem ser convertidos em quantidades e unidades mensuráveis padrão no programa de análise de dados como o Excel.A largura do traço corresponde ao comprimento do crescimento. O hight representa a duração do crescimento, e o ângulo da linha dá a direção dos cometas. Esses cometas ainda podem ser classificados em plus-end-out e menos-end-out, para encontrar a orientação relativa dos microtúbulos.A expressão transgênica do GFP EBTA pode ser adaptada para observar a dinâmica dos microtúbulos em vários contextos celulares, como a nova regeneração. Para observar a dinâmica dos microtúbulos nos axônios de classificação da região, o axônio é ferido usando um laser femtosegundo, que pode cortar o axônio precisamente sem causar danos colaterais maciços. Após a lesão, os vermes podem ser recuperados em placas de motor semeadas para observações posteriores.Os neurônios PLM apresentam regeneração robusta de exoneree, que pode ser observada até seis horas após a lesão. Para evitar que a fototoxicidade regenere novos direitos, a imagem ao vivo é realizada em um microscópio de disco giratório. As aquisições de lapso de tempo dos axônios regeneradores podem mais tarde ser convertidas em kymographs para a análise de cometas.A duração e direção da distância dos cometas podem então ser interpretadas em termos de orientação e dinâmica de microtúbulos. Minha orientação crítica e dinâmica são determinantes fundamentais de processos celulares civis como divisão celular, migração e manutenção da arquitetura celular. Embora existam muitas ferramentas disponíveis para a medição da dinâmica microtúbula na medição in vivo pode ser desafiadora.Autoflorescência, toxicidade fotográfica, artefato de expressão e intensidades variáveis relatadas são algumas das dificuldades encontradas durante a observação ao vivo de proteínas de ligação final, para avaliar a dinâmica dos microtúbulos. Utilizando um transgênico integrado com baixa concentração de DNA deportado e baixa iluminação, este estudo abordou métodos para mitigar alguns desses desafios. Os módulos de imagem e análise descritos aqui podem ser estendidos para outros repórteres baseados em microtúbulos e transporte de proteínas.Isso não é apenas aplicável aos neurônios c.elegância, mas pode ser aplicado a outros tipos de células e sistemas de modelos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

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Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

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Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

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It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...