Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Мы благодарим Иши Джина и Эндрю Чисхолма за первоначальную поддержку и штамм, использованный в исследовании. Бактериальный штамм OP50 был коммерчески использован Центром генетики Caenorhabditis (CGC), финансируемым Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы также благодарим Дхармендру Пури за стандартизацию экспериментальных процедур. Исследование финансируется за счет основного гранта Национального центра исследований мозга (при поддержке Департамента биотехнологии правительства Индии), гранта DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (грант No IA/E/18/1/504331) S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (грант No IA/I/13/1/500874) для A.G.-R и гранта От Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB: CRG/2019/002194) для A.G.-R.

1. Репортерное напряжение: культура и поддержание
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения динамики микротрубочек и ориентации в нейронах PLM мы использовали штамм червя, экспрессирующий EBP-2::GFP под сенсорным нейроном специфическим промотором mec-4 (аллель juIs338) <...

Понимание динамики микротрубочек было ключевым направлением в области исследований цитоскелетов на протяжении многих лет. Микротрубочки претерпевают зародышивание и катастрофу вместе с непрерывным процессом динамической нестабильности44, 45,<sup c...

Нейроны имеют сложную архитектуру со специализированными компартментами, такими как дендриты, клеточные тела, аксоны и синапсы. Нейрональный цитоскелет состоит из микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов, и их отчетливая организация поддерживает нейронные компартменты структурно и функционально1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . На протяжении многих лет организация микротрубочек была идентифицирована как ключевой детерминант полярности и функции нейронов. Поскольку нейроны подвергаются структурному ремоделированию во время развития или регенерации, динамика и ориентация микротрубочек определяют идентичность, поляризованный транспорт, рост и развитие различных нейронных компартментов7. Поэтому крайне важно оценить динамику и ориентацию микротрубочек in vivo, чтобы коррелировать с процессом ремоделирования нейронов.
Микротрубочки состоят из протофиламентов гетеродимеров α и β тубулина с динамическими плюс-концами и относительно стабильными минус-концами11,12. Открытие комплекса плюс-наконечника и связанных с ним конечных связывающих белков позволило платформе оценить организацию микротрубочек13. Конечные связывающие белки (EBP) временно связываются с растущими плюс концем микротрубочек и их ассоциативная динамика коррелирует с ростом протофиламентов микротрубочек14,15. Из-за частой ассоциации и диссоциации комплекса плюс наконечника с микротрубочкой функция точечного распространения GFP-помеченного EBP появляется как «комета» в таймлапс-ролике15,16. Начиная с новаторского наблюдения за нейронами млекопитающих16,конечные связывающие белки, помеченные флуоресцентными белками, использовались для определения динамики микротрубочек в различных модельных системах и типах нейронов17,18,19,20,21,22,23.
Благодаря своей простой нервной системе и прозрачному телу, C. elegans зарекомендовал себя как отличная модельная система для изучения ремоделирования нейронов во время развития и регенерации in vivo. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированный EBP-2::GFP, мы визуализировали микротрубочки в нейроне PLM, что позволило нам определить полярность микротрубочек в двух разных нейритах этого нейрона24. Этот метод позволяет наблюдать и количественно оценивать кометы EBP как меру динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, например, локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть оценены с использованием нашего протокола. Этот анализ может быть адаптирован для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах в различных типах клеток и генетическом фоне.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

В нейронах ориентация микротрубочек была ключевым оценщиком для идентификации аксонов, которые имеют плюсовые микротрубочки и дендриты, которые обычно имеют смешанную ориентацию. Здесь описаны методы маркировки, изображения и анализа динамики и роста микротрубочек при развитии и регенерации сенсорных нейронов у C. elegans. Используя генетически закодированные флуоресцентные репортеры кончиков микротрубочек, мы визуалировали аксональные микротрубочки. Локальные изменения в поведении микротрубочек, которые инициируют регенерацию аксонов после аксотомии, могут быть количественно определены с помощью этого протокола. Этот анализ адаптируется к другим нейронам и генетическим фонам для исследования регуляции динамики микротрубочек в различных клеточных процессах.

В качестве репрезентативного примера мы описали наблюдение in vivo комет EBP в стационарном состоянии и регенерирующими аксонами нейронов PLM. PLM-нейроны расположены в хвостовой области червя с длинным передним отроском, образующий синапс и короткий задний отроск. Нейроны PLM растут в передн?...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Представлен протокол визуализации динамических микротрубочек in vivo с использованием флуоресцентно меченого конечного связывающего белка. Описаны методы маркировки, изображения и анализа динамических микротрубочек в заднем боковом микротрубочке (PLM) нейрона C. elegans.

In vivo Оценка динамики и ориентации микротрубочек в нейронах Caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Целью данной процедуры является оценка организации и динамики микротрубочек in vivo. Нейроны представляют собой поляризованные клетки с отчетливыми аксональными, дендритными и синаптическими компартментами, поддерживаемыми их основным цитоскелетом. Микротрубочки образуют большую часть нейронального цитоскелета, а динамика и ориентация определяют ключевые события во время развития и созревания нейронов.Микротрубочки состоят из гетеродимеров альфа- и бета-тубулина и по своей природе поляризованы с высокодинамичными плюс-концами и стабильными минус-концами. Во время полимеризации на плюс-концах, многомолекулярный комплекс концевых связывающих белков, временно связывается с протофиламентами и способствует сборке тубулиновых димеров. Эта методика поможет нам визуализировать нейронные микротрубочки in vivo.С помощью этой методики можно определить ориентацию и другие параметры динамических микротрубочек при развитии и регенерации нейрона C.elegans. Мы обычно используем этот репортер для визуализации динамики микротрубочек в сенсорных нейронах. Тем не менее, можно экспрессировать этот репортер в других типах клеток, таких как мышцы и кожа, чтобы визуализировать динамические микротрубочки в этих клетках.Флуоресцентно меченые концевы связующие белки, такие как EBP к GFP здесь, выглядят как кометы. Динамика этих комет коррелирует с сопутствующим ростом микротрубочек и является ключевым показателем для измерения динамики и ориентации микротрубочек. Для того чтобы наблюдать эти кометы в определенном типе клеток, трансгены с ДНК EBP-2 и GFP экспрессируются под определенным промотором.Для экспрессии в нейронах PLM этот трансген экспрессируется под make for promoter. Эти трансгенные черви можно просматривать под стереомикроскопом, с флуоресценцией, установленной перед сортировкой или монтажом. Для установки червей для визуализации комет EBP мы делаем 10% Argos в буфере M9.и поместите каплю на стеклянную горку. Другой слайд используется для вдавливания капли в пленку, которая затвердеет в подушечку. В качестве монтажной среды мы используем 0,1 мкм, полистирольные шарики, несколько червей собирают и повторно суспендируем в бисерном растворе.Крышка браконьера, чтобы обездвижить червей и взята для визуализации. Установленные могут быть изображены на любом флуоресцентном микроскопе с камерой для получения изображений высокого разрешения. Установка оснащена вращающимся дисковым блоком для более быстрого сбора и снижения фотоотбеливания и фототоксичности.Слайд удерживается на сцене, а поле червей фокусируется и центрируется с помощью ярко-полевого освещения. Для этой цели можно использовать объектив с низким увеличением, такой как 5X или 10X. Черви могут быть перефокусированы при высоком увеличении цели, такой как 63X, используя ту же подсветку.Эта цель обеспечивает оптимальное пространственное разрешение для визуализации комет. Фиксированное центрирование PLM-нейрона выполняется под флуоресцентной подсветкой, чтобы предотвратить чрезмерное воздействие света и фотоотбеливание прума. Для получения изображений мы используем программное обеспечение для отправки с сайтов.Используя конфигурацию изображения в реальном времени в канале brightfield, мы фокусируем хвостовую область червя и центрируем ее в поле зрения. За этим следует фокусировка нейрона PNM с использованием конфигурации световой визуализации с 488-нанометровым светом возбуждения. Для покадрового захвата создается экспериментальная установка, где время экспозиции, продолжительность таймлапса и интервал между кадрами определяют временные навыки визуализации.Для количественных измерений некоторые фильмы комет EBP должны быть проанализированы на Image J, который является программным обеспечением с открытым исходным кодом. Полученная временная съемка открывается как многообразная нить, которую можно предварительно просмотреть как фильм. В этом конкретном промежутке времени кометы можно увидеть в теле клетки, переднем и заднем отроще нейрона PLM.Кометы, отошедших от тела клетки, классифицируются как плюс-конец, а те, которые движутся к телу клетки, классифицируются как минус-конец. Для начала анализа проводится сегментированная линия над интересуемой областью, которая в данном случае является внутренним процессом PLM-нейрона. Этот отрезок линии преобразуется в кимограф с помощью функции реликтов изображений.Кимограф представляет собой изображение времени расстояния с диагональными складками, представляющими движущиеся кометы. На этих трассах можно нарисовать прямые сегменты, а параметры измерения можно задать с помощью меню анализа. Эти параметры могут быть преобразованы в стандартные измеримые величины и единицы измерения в программе анализа данных, такой как Excel.Ширина следа соответствует длине роста. Высокая часть представляет продолжительность роста, а угол складки дает направление комет. Эти кометы могут быть дополнительно классифицированы на плюс-конец и минус-конец, чтобы найти относительную ориентацию микротрубочек.Трансгенная экспрессия EBTA GFP может быть адаптирована для наблюдения динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, таких как новая регенерация. Чтобы наблюдать динамику микротрубочек в области рейтинговых аксонов, аксон травмируется с помощью фемтосекундного лазера, который может точно разорвать аксон, не вызывая массивного побочного ущерба. После травмы черви могут быть восстановлены на засеянных пластинах двигателя для последующих наблюдений.Нейроны PLM демонстрируют надежную регенерацию экзонеров, которую можно наблюдать уже через шесть часов после травмы. Чтобы предотвратить фототоксичность к регенерации новых прав, живая визуализация проводится в вращающемся дисковом микроскопе. Покадровые приобретения регенерирующими аксонами впоследствии могут быть преобразованы в кимографы для анализа комет.Продолжительность расстояния и направление комет могут быть интерпретированы с точки зрения ориентации и динамики микротрубочек. Моя критическая ориентация и динамика являются ключевыми определяющими факторами гражданских клеточных процессов, таких как деление клеток, миграция и поддержание клеточной архитектуры. Хотя существует множество инструментов, доступных для измерения динамики микротрубочек, измерение in vivo может быть сложным.Автоцветульность, фототоксичность, артефакт экспрессии и переменные интенсивности , являются одними из трудностей, возникающих во время живого наблюдения за конечными связывающими белками для оценки динамики микротрубочек. Используя интегрированный трансген с низкой концентрацией депортированной ДНК и визуализацией с низкой освещенностью, это исследование рассмотрело методы смягчения некоторых из этих проблем. Модули визуализации и анализа, описанные здесь, могут быть расширены на другие репортеры на основе микротрубочек и транспорт белка.Это применимо не только к нейронам C.elegance, но и может быть применено к другим типам клеток и модельным системам.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

В естественных условиях лазерной Axotomy на языке C. Элеганс

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны<em&gt; В естественных условиях</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric кальция изображений отдельных нейронов в себя Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...