Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Agradecemos a Yishi Jin y Andrew Chisholm por el apoyo inicial y la cepa utilizada en el estudio. La cepa bacteriana OP50 fue aprovechada comercialmente del Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). También agradecemos a Dharmendra Puri por la estandarización de los procedimientos experimentales. El estudio está financiado por la subvención básica del Centro Nacional de Investigación del Cerebro (apoyado por el Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/ E/18/1/504331) a S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1/500874) a A.G.-R y una subvención de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERB: CRG/2019/002194) a A.G.-R.

1. Cepa reportera: Cultura y mantenimiento
NOTA: Para medir la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas PLM, utilizamos la cepa de gusano que expresa EBP-2::GFP bajo el promotor específico de la neurona táctil mec-4 (alelo juIs338) 18,25,26. Utilizamos métodos estándar de cultivo y mantenimiento de gusanos para esta...

La comprensión de la dinámica de los microtúbulos ha sido un enfoque clave en el campo de la investigación citoesquelética a lo largo de los años. Los microtúbulos sufren nucleación y catástrofe junto con un proceso continuo de inestabilidad dinámica44,45,46,47. Gran parte de esta información se ha obtenido a través de ensayos in vitro como lecturas de d...

Las neuronas tienen una arquitectura elaborada con compartimentos especializados como dendritas, cuerpos celulares, axones y sinapsis. El citoesqueleto neuronal está constituido por los microtúbulos, microfilamentos y neurofilamentos y su organización distinta soporta los compartimentos neuronales estructural y funcionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . A lo largo de los años, la organización de los microtúbulos se ha identificado como un determinante clave de la polaridad y función neuronal. A medida que las neuronas experimentan una remodelación estructural durante el desarrollo o la regeneración, la dinámica y la orientación de los microtúbulos determinan la identidad, el transporte polarizado, el crecimiento y el desarrollo de varios compartimentos neuronales7. Por lo tanto, es imperativo evaluar la dinámica y la orientación de los microtúbulos in vivo para correlacionarlos con el proceso de remodelación neuronal.
Los microtúbulos están compuestos por protofilamentos de α y β heterodímeros de Tubulina con extremos más dinámicos y extremos menos relativamente estables11,12. El descubrimiento del complejo de punta más y las proteínas de unión final asociadas han permitido una plataforma para evaluar la organización de los microtúbulos13. Las proteínas de unión al final (EBP) se asocian transitoriamente con los extremos de crecimiento más del microtúbulo y su dinámica de asociación se correlaciona con el crecimiento de los protofilamentos de microtúbulos14,15. Debido a la frecuente asociación y disociación del complejo de punta más con el microtúbulo, la función de dispersión puntual del EBP marcado con GFP aparece como un "cometa" en una película de lapso de tiempo15,16. Desde la observación pionera en neuronas de mamíferos16,las proteínas de unión final marcadas con proteínas fluorescentes se han utilizado para determinar la dinámica de microtúbulos a través de diferentes sistemas modelo y tipos de neuronas17,18, 19,20, 21,22,23.
Debido a su sistema nervioso simple y cuerpo transparente, C. elegans ha demostrado ser un excelente sistema modelo para estudiar la remodelación neuronal durante el desarrollo y la regeneración in vivo. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Utilizando EBP-2::GFP codificado genéticamente, tomamos imágenes de los microtúbulos en la neurona PLM, lo que nos permitió determinar la polaridad de los microtúbulos en dos neuritas diferentes de esta neurona24. Este método permite la observación y cuantificación de los cometas EBP como medida de la dinámica de los microtúbulos en diferentes contextos celulares, por ejemplo, los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración de los axones después de la axotomía se pueden evaluar utilizando nuestro protocolo. Este ensayo se puede adaptar para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares en diversos tipos de células y antecedentes genéticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

En las neuronas, la orientación de los microtúbulos ha sido un evaluador clave para identificar los axones que tienen microtúbulos y dendritas de extremo superior que generalmente tienen una orientación mixta. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Usando reporteros fluorescentes codificados genéticamente de puntas de microtúbulos, tomamos imágenes de los microtúbulos axonales. Los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración del axón después de la axotomía se pueden cuantificar utilizando este protocolo. Este ensayo es adaptable a otras neuronas y antecedentes genéticos para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares.

Como ejemplo representativo, hemos descrito la observación in vivo de los cometas EBP en estado estacionario y los axones regeneradores de las neuronas PLM. Las neuronas PLM se encuentran en la región de la cola del gusano con un proceso anterior largo que forma una sinapsis y un proceso posterior corto. Las neuronas PLM crecen en la dirección anterior-posterior cerca de la epidermis y son responsables de la suave sensación de tacto en los gusanos. Debido a su estructura simplificada y su facilidad para la obtención...

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In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

El objetivo de este procedimiento es evaluar la organización y dinámica de los microtúbulos in vivo. Las neuronas son células polarizadas con distintos compartimentos axonales, dendríticos y sinápticos, mantenidos por su citoesqueleto subyacente. Los microtúbulos forman la mayoría del citoesqueleto neuronal, y la dinámica y la orientación determinan los eventos clave durante el desarrollo y la maduración neuronal.Los microtúbulos están compuestos por heterodímeros de tubulina alfa y beta, y están inherentemente polarizados con extremos más altamente dinámicos y extremos negativos estables. Durante la polimerización en los extremos superiores, un complejo multimolecular de proteínas de unión al extremo, se asocia transitoriamente con los protofilamentos y promueve el ensamblaje de dímeros de tubulina. Esta técnica nos ayudará a visualizar microtúbulos neurales in vivo.Usando esta técnica, se puede determinar la orientación y otros parámetros de los microtúbulos dinámicos durante el desarrollo y la regeneración de la neurona C.elegans. Por lo general, usamos este reportero para visualizar la dinámica de los microtúbulos en la neurona sensorial. Sin embargo, uno puede expresar este reportero en otros tipos de células, como los músculos y la piel, para visualizar microtúbulos dinámicos en estas células.Las proteínas de unión al extremo etiquetadas fluorescentemente como EBP a GFP aquí, aparecen como cometas. La dinámica de estos cometas se ha correlacionado con el crecimiento concomitante de los microtúbulos, y un indicador clave para medir la dinámica y orientación de los microtúbulos. Para observar estos cometas en un tipo celular específico, los transgenes con ADN de EBP-2 y GFP se expresan bajo un promotor específico.Para la expresión en las neuronas PLM, este transgén se expresa bajo la marca para promotor. Estos gusanos transgénicos se pueden ver bajo un microscopio estereoscópico, con fluorescencia configurada antes de clasificarlos o montarlos. Para montar los gusanos para obtener imágenes de cometas EBP, hacemos un 10% Argos en el búfer M9.y coloque una gota en un portaobjetos de vidrio. Otra diapositiva se utiliza para presionar la gota en una película que se solidifica en una almohadilla. Utilizamos perlas de poliestireno de 0,1 micras como medio de montaje, se recogen algunos gusanos y se vuelven a suspender en la solución de perlas.Se caza furtivamente un resbalón de cubierta para inmovilizar los gusanos y se toma para obtener imágenes. Los montados se pueden obtener imágenes en cualquier microscopio de fluorescencia con una cámara para imágenes de alta resolución. La configuración está equipada con una unidad de disco giratorio para una adquisición más rápida y un blanqueamiento fotográfico y una toxicidad fotográfico reducidos.La diapositiva se mantiene en el escenario y el campo de gusanos se enfoca y centra utilizando la iluminación de campo brillante. Un objetivo de bajo aumento como 5X o 10X se puede utilizar para este propósito. Los gusanos se pueden volver a enfocar a un objetivo de gran aumento como 63X utilizando la misma iluminación.Este objetivo proporciona una resolución espacial óptima para la obtención de imágenes de los cometas. Un centrado fijo de la neurona PLM se realiza bajo la iluminación de fluorescencia para evitar la exposición indebida a la luz y el fotonco blanqueamiento del suero. Para la adquisición de imágenes utilizamos software de envío fuera de los sitios.Utilizando la configuración de imágenes en vivo en el canal de campo brillante, enfocamos la región de la cola del gusano y la centramos en el campo de visión. Esto es seguido por el enfoque de la neurona PNM utilizando la configuración de imágenes de luz con luz de excitación de 488 nanómetros. Para una adquisición de lapso de tiempo, se crea un entorno experimental donde el tiempo de exposición, la duración del lapso de tiempo y el intervalo entre los fotogramas definen las habilidades temporales de la imagen.Para mediciones cuantitativas, algunas películas de cometas EBP se analizarán en la Imagen J, que es un software de código abierto. El lapso de tiempo adquirido se abre como una cadena de varias imágenes, que se puede previsualizar como una película. En este lapso de tiempo en particular, los cometas se pueden ver en el cuerpo celular, el proceso anterior y posterior de la neurona PLM.Los cometas que se alejan del cuerpo celular se clasifican como más-extremo-out, y los que se mueven hacia el cuerpo celular se clasifican como menos-extremo-fuera. Para comenzar el análisis se dibuja una línea segmentada sobre la región de interés, que en este caso es el proceso interior de la neurona PLM. Este segmento de línea se convierte en un kymograph utilizando la función de reslice de imágenes.Un kymograph es una imagen de distancia temporal con pliegues diagonales que representan los cometas en movimiento. Los segmentos de línea recta se pueden dibujar en estas trazas y los parámetros de medición se pueden establecer utilizando el menú de análisis. Estos parámetros se pueden convertir a cantidades y unidades medibles estándar en el programa de análisis de datos como Excel.El ancho de la traza corresponde a la longitud de crecimiento. El hight representa la duración del crecimiento, y el ángulo del pliegue da la dirección de los cometas. Estos cometas se pueden clasificar en más-extremo-fuera y menos-extremo-fuera, para encontrar la orientación relativa de los microtúbulos.La expresión transgénica de EBTA GFP se puede adaptar para observar la dinámica de los microtúbulos en diversos contextos celulares, como la nueva regeneración. Para observar la dinámica de los microtúbulos en los axones de clasificación de la región, el axón se lesiona utilizando un láser de femtosegundo, que puede corte el axón con precisión sin causar daños colaterales masivos. Después de la lesión, los gusanos se pueden recuperar en placas de motor secuestas para observaciones posteriores.Las neuronas PLM muestran una regeneración exoneree robusta, que se puede observar tan pronto como seis horas después de la lesión. Para evitar la fototoxicidad para regenerar nuevos derechos, las imágenes en vivo se llevan a cabo en un microscopio de disco giratorio. Las adquisiciones de lapso de tiempo de los axones regeneradores se pueden convertir posteriormente en kymographs para el análisis de cometas.La duración de la distancia y la dirección de los cometas se pueden interpretar en términos de orientación y dinámica de los microtúbulos. Mi orientación crítica y dinámica son determinantes clave de los procesos celulares civiles como la división celular, la migración y el mantenimiento de la arquitectura celular. Aunque hay muchas herramientas disponibles para la medición de la dinámica de microtúbulos, la medición in vivo puede ser un desafío.La autoflorescencia, la fototoxicidad, el artefacto de sobreexpresión y las intensidades variables reportadas son algunas de las dificultades encontradas durante la observación en vivo de proteínas de unión al extremo, para evaluar la dinámica de los microtúbulos. Mediante el uso de un transgénico integrado con baja concentración de ADN deportado e imágenes de baja iluminación, este estudio ha abordado métodos para mitigar algunos de estos desafíos. Los módulos de imágenes y análisis descritos aquí se pueden extender hacia otros reporteros basados en microtúbulos y transporte de proteínas.Esto no solo es aplicable a las neuronas C.elegance, sino que también se puede aplicar a otros tipos de células y sistemas modelo.

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