Name: in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Vi tackar Yishi Jin och Andrew Chisholm för det initiala stödet och den stam som används i studien. Bakteriestammen OP50 utnyttjades kommersiellt från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi tackar också Dharmendra Puri för standardiseringen av de experimentella förfarandena. Studien finansieras genom kärnbidrag från National Brain Research Centre (med stöd av Institutionen för bioteknik, Govt. av Indien), DBT/Wellcome förtroende Indien allians tidig sortkarriärbidrag (anslag # IA/E/18/1/504331) till S.D., Wellcome förtroende-DBT Indien allians intermediate anslag (anslag # IA/I/13/1/500874) till A.G.-R och ett anslag från vetenskap och iscensätta forskningsnämnden (SERB: CRG/2019/002194) till A.G.-R.

1. Reporterstam: Kultur och underhåll
OBS: För att mäta mikrotubuledynamiken och orienteringen i PLM-nervcellerna använde vi maskstammen som uttrycker EBP-2::GFP under den beröringsneurospecifika promotorn mec-4 (juIs338 allel)18,25,26. Vi använder standardmaskkultur och underhållsmetoder för denna stam27.</p...

Att förstå mikrotubuledynamiken har varit ett centralt fokus inom området cytoskeletal forskning genom åren. Mikrotubuler genomgår nukleation och katastrof tillsammans med en kontinuerlig process av dynamisk instabilitet44,45,46,47. Mycket av denna information har erhållits genom in vitro-analyser som ljusspridningsutläsningar av fritt vs polymeriserat tubuli...

Neuroner har en utarbetad arkitektur med specialiserade fack som dendriter, cellkroppar, axoner och synapser. Neuronal cytoskeleton består av mikrotubuler, mikrofilament och neurofilament och deras distinkta organisation stöder neuronala fack strukturellt och funktionellt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Under årens lopp har microtubule organisation identifierats som en viktig determinant för neuronal polaritet och funktion. Eftersom nervceller genomgår strukturell ombyggnad under utveckling eller regenerering bestämmer mikrotubuledynamiken och orienteringen identiteten, polariserade transporter, tillväxt och utveckling av olika neuronala fack7. Det är därför absolut nödvändigt att bedöma mikrotubuledynamiken och orienteringen in vivo för att korrelera med den neuronala ombyggnadsprocessen.
Mikrotubuler består av protofilament av α och β Tubulin heterodimers med dynamiska plusändar och relativt stabila minus ändar11,12. Upptäckten av plusspetskomplexet och tillhörande slutbindande proteiner har gjort det möjligt för en plattform att bedöma mikrotubuleorganisationen13. Slutbindande proteiner (EBP) associeras tillfälligt med mikrotubuleens växande plusändar och deras associationsdynamik korreleras till tillväxten av mikrotubuleprotofilamenten14,15. På grund av frekvent association och dissociation av plusspetskomplex med mikrotubule visas punktspridningsfunktionen för GFP-märkt EBP som en "komet" i en timelapse-film15,16. Sedan den banbrytande observationen i däggdjursneuroner16, har slutbindande proteiner märkta med fluorescerande proteiner använts för att bestämma mikrotubuledynamiken i olika modellsystem och neurontyper17,18,19,20,21,22,23.
På grund av sitt enkla nervsystem och transparenta kropp har C. elegans visat sig vara ett utmärkt modellsystem för att studera neuronal ombyggnad under utveckling och regenerering in vivo. Här beskriver vi metoder för att märka, avbilda och analysera mikrotubuledynamiken och tillväxten under utveckling och regenerering av beröringsneuroner i C. elegans. Med hjälp av genetiskt kodade EBP-2::GFP, vi avbildade mikrotubulerna i PLM-neuron, vilket gjorde det möjligt för oss att bestämma polariteten hos mikrotubulerna i två olika neuriter av denna neuron24. Denna metod möjliggör observation och kvantifiering av EBP-kometer som ett mått på mikrotubuledynamik i olika cellulära sammanhang, till exempel kan de lokala förändringarna i mikrotubulebeteende som initierar axonregenerering efter axotomi bedömas med hjälp av vårt protokoll. Denna analys kan anpassas för att undersöka regleringen av mikrotubuledynamik i olika cellulära processer i olika celltyper och genetiska bakgrunder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CZ18975 worm strain</td>
			<td>Yishi Jin lab</td>
			<td>CZ18975</td>
			<td>Generated by Anindya Ghosh-Roy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9010-000</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath with heating block</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides (35 mm x 25 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>00876</td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mounting worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 bacterial strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific</td>
			<td>20440</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator/Capillary</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-921</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR554E</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with fluorescence attachment</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td>Worm handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Peptone</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mg/mL Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mM Magnesium sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Agar</td>
			<td>T M Media</td>
			<td>1202</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04M Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M Ammonium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21405</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td>1X M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td>Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Evolve 512 Delta</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Spinning Disk unit</td>
			<td>HP</td>
			<td>Intel &#174; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury Arc Lamp</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Fiji Version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Creative Cloud</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system for Image Analysis</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Intel &#174; Core &#8482; i7-9700 CPU 3.00GHz</td>
			<td>Image processing/Representation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of microtubule dynamics and orientation in caenorhabditis elegans neurons

I nervceller har microtubule orientering varit en viktig bedömare för att identifiera axoner som har plus-end ut mikrotubuler och dendriter som i allmänhet har blandad orientering. Här beskriver vi metoder för att märka, avbilda och analysera mikrotubuledynamiken och tillväxten under utveckling och regenerering av beröringsneuroner i C. elegans. Med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande reportrar av mikrotubulespetsar avbildade vi de axonal mikrotubulerna. De lokala förändringarna i mikrotubule beteende som initierar axon regenerering efter axotomy kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll. Denna analys är anpassningsbar till andra nervceller och genetiska bakgrunder för att undersöka regleringen av mikrotubuledynamik i olika cellulära processer.

Som ett representativt exempel har vi beskrivit in vivo observation av EBP kometer i steady-state och regenerera axons av PLM nervceller. PLM-nervceller ligger i maskens svansregion med en lång främre process som bildar en synaps och en kort bakre process. PLM-nervceller växer i den främre bakre riktningen nära epidermis och är ansvariga för den milda beröringskänslan i maskarna. På grund av deras förenklade struktur, och mottaglighet för bildbehandling och mikrokirurgi, PLM nervceller har undersökts utförl...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Ett protokoll för avbildning av de dynamiska mikrotubulerna in vivo med fluorescerande märkt End bindande protein har presenterats. Vi beskrev metoderna för att märka, bild och analysera de dynamiska mikrotubulerna i bakre laterala microtubule (PLM) neuron av C. elegans.

In vivo Bedömning av mikrotubuledynamik och orientering i Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Syftet med detta förfarande är att bedöma mikrotubuleorganisationen och dynamiken in vivo. Nervceller är polariserade celler med distinkta axonal, dendritic och synaptic fack, underhålls av deras underliggande cytoskeleton. Microtubules utgör majoriteten av neuronal cytoskeleton, och dynamiken och orienteringen bestämmer viktiga händelser under neuronal utveckling och mognad.Mikrotubuli består av alfa- och beta tubulin heterodimerer och är till sin natur polariserade med mycket dynamiska plus-ändar och stabila minusändar. Under polymerisation vid plus-ends associerar ett multimolekylligt komplex av endbindande proteiner, övergående med protofilament och främjar monteringen av tubulin dimers. Denna teknik hjälper oss att visualisera neurala mikrotubuli in vivo.Med hjälp av denna teknik kan man bestämma orientering och andra parametrar för dynamiska mikrotubuler under utveckling och regenerering av C.elegans neuron. Vi använder vanligtvis denna reporter för att visualisera microtubule dynamik i sensorisk neuron. Man kan dock uttrycka denna reporter i andra celltyper som muskler och hud för att visualisera dynamiska mikrotubuli i dessa celler.Fluorescerande märkta endbindningsproteiner som EBP till GFP här framträder som kometer. Dynamiken hos dessa kometer har korrelerats med samtidig tillväxt av mikrotubulerna och en nyckelindikator för att mäta mikrotubuledynamik och orientering. För att observera dessa kometer i en viss celltyp uttrycks transgen med DNA från EBP-2 och GFP under en specifik promotor.För uttryck i PLM nervceller, denna transgene uttrycks under make for promotor. Dessa transgena maskar kan ses under ett stereomikroskop, med fluorescens inställd före sortering eller montering. För montering av maskarna för avbildning av EBP-kometer gör vi en 10% Argos i M9-buffert.och placera en droppe på en glasrutschbana. En annan bild används för att trycka in droppen i en film som stelnar i en platta. Vi använder 0,1 mikron, polystyrenpärlor som monteringsmedium, några maskar plockas och suspenderas igen i pärllösningen.En täcklapp pocheras för att immobilisera maskarna och tas för avbildning. De monterade kan avbildas på alla fluorescensmikroskop med en kamera för högupplöst avbildning. Installationen är utrustad med en snurrande diskenhet för ett snabbare förvärv och minskad fotoblekning och fototoxicitet.Bilden hålls på scenen och maskfältet är fokuserat och centrerat med hjälp av belysningen av det ljusa fältet. Ett mål med låg förstoring som 5X eller 10X kan användas för detta ändamål. Maskarna kan fokuseras på ett högt förstoringsmål som 63X med samma belysning.Detta mål ger en optimal rumslig upplösning för avbildning av kometerna. En fast centrering av PLM-neuron görs under fluorescensbelysningen för att förhindra onödig ljusexponering och fotoblekning av prum. För bildförvärvet använder vi skicka programvara från webbplatser.Med hjälp av live imaging konfiguration i brightfield kanalen, Vi fokuserar svans regionen av masken och centrera den i synfältet. Detta följs av fokusering av PNM-neuron med hjälp av ljusavbildningskonfiguration med 488 nanometer excitationsljus. För ett tidsfördröjningsförvärv skapas en experimentell inställning där exponeringstid, tidsfördröjningstid och intervallet mellan bildrutorna definierar avbildningens temporala färdigheter.För kvantitativa mätningar ska vissa filmer av EBP-kometer analyseras på Bild J, som är en öppen källkodsprogramvara. Den förvärvade tidsfördröjningen öppnas som en flerbildssträng som kan förhandsgranskas som en film. I denna speciella tidsfördröjning kan kometer ses i cellkroppen, främre och bakre processen i PLM-neuronen.Kometerna som rör sig bort från cellkroppen klassificeras som plus-end-out, och de som rör sig mot cellkroppen klassificeras som minus-end-out. För att börja analysen dras en segmenterad linje över intresseområdet, vilket i detta fall är den inre processen för PLM-neuronen. Det här linjesegmentet konverteras till en kymografi med hjälp av relikerfunktionen för bilder.En kymografi är en avståndstidsbild med diagonala veck som representerar de rörliga kometer. Raka linjesegment kan ritas på dessa spår och mätparametrar kan ställas in med hjälp av analysmenyn. Dessa parametrar kan konverteras till standard mätbara kvantiteter och enheter i dataanalysprogrammet som Excel.Spårningens bredd motsvarar tillväxtlängden. Höjden representerar tillväxtvaraktighet, och vinkeln på vecket ger kometerriktningen. Dessa kometer kan vidare klassificeras i plus-end-out och minus-end-out, för att hitta den relativa orienteringen av mikrotubuli.Transgena uttryck av EBTA GFP kan anpassas för att observera mikrotubuledynamik i olika cellulära sammanhang, såsom ny regenerering. För att observera mikrotubuledynamiken i regionens klassning axoner, axon skadas med hjälp av en femtosekundslaser, som kan skära axon exakt utan att orsaka massiva sidoskador. Efter skadan kan maskarna återvinnas på sådda motorplattor för senare observationer.PLM nervceller visar robust exoneree regenerering, som kan observeras så tidigt som sex timmar efter skada. För att förhindra fototoxicitet för att regenerera nya rättigheter utförs live imaging i ett snurrande diskmikroskop. Timelapse förvärv av regenererande axoner kan senare omvandlas till kymographs för analys av kometer.Kometernas avståndslängd och riktning kan sedan tolkas i termer av mikrotubuleorientering och dynamik. Min kritiska orientering och dynamik är viktiga bestämningar av civila cellulära processer som celldelning, migrering och underhåll av cellulär arkitektur. Även om det finns många verktyg tillgängliga för mätning av mikrotubuledynamik in vivo mätning kan vara utmanande.Autoflorescence, foto toxicitet, över uttryck artefakt och variabla rapporterade intensiteter är några av de svårigheter som uppstår under levande observation av end-binding proteiner, att bedöma microtubule dynamiken. Genom att använda en integrerad transgenisk med låg koncentration av deporterat DNA och låg belysningsavbildning har denna studie tagit upp metoder för att mildra några av dessa utmaningar. De bild- och analysmoduler som beskrivs här kan utvidgas till andra mikrotubulebaserade reportrar och proteintransport.Detta är inte bara tillämpligt på C.elegance nervceller, men kan tillämpas på andra celltyper och modellsystem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

ETT<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modellsystem för Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk märkning av pyramidal neuroner i hjärnan skivor och i primär cell kultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...