Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Vi takker Miriam Bünning for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 til A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD til A.P.), og det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) (e: Bio ung etterforsker gi AZ 031L0211 til A.P.). Arbeidet i laboratoriet til C.R.R. ble støttet av DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).

MERK: Bruk av menneskelige iPSCer kan kreve en etisk godkjenning. iPSC som ble brukt i denne studien ble avledet fra friske kontrollpersoner etter lokal etisk godkjenning (#2019-681). Alle cellekulturprosedyrer må utføres under en steril cellekulturhette, og desinfiserer forsiktig alle reagenser og forbruksvarer før de overføres under hetten. Humane iPSCer som brukes til differensiering bør ha et passasjenummer under 50 for å unngå potensielle genomiske avvik som kan oppstå ved omfattende kultur. Cellenes pluripo...

<ol>
	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA:+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems.">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li><li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+hope+for+the+future.">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li><li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases.">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li><li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease.">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease.">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li><li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons.">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration.">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378 (2016).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders.">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease.">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li><li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo.">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

Dette dokumentet beskriver den reproduserbare generasjonen av humane iPSC-avledede hjerneorganoider og deres bruk for mitokondriesykdomsmodellering. Protokollen som er beskrevet her, endres basert på et tidligere publisert arbeid20. En stor fordel med den nåværende protokollen er at den ikke krever manuell innebygging av hvert organoid i en stillasmatrise. Faktisk er matriseløsningen ganske enkelt oppløst i cellekulturmediet. Videre er det ikke nødvendig å bruke dyre bioreaktorer, da organo...

Mitokondriesykdommer representerer den største klassen av medfødte feil i metabolismen1. De er forårsaket av genetiske mutasjoner som forstyrrer forskjellige mitokondrieprosesser, inkludert oksidativ fosforylering (OXPHOS)2, respiratorisk kjedemontering, mitokondriedynamikk og mitokondrie-DNA-transkripsjon eller replikering3. Vev med energibehov påvirkes spesielt av mitokondrie dysfunksjon4. Følgelig utvikler pasienter med mitokondriesykdommer vanligvis tidlige nevrologiske manifestasjoner.
Det finnes for tiden ingen behandlinger tilgjengelig for barn som er rammet av mitokondriesykdommer5. En stor hindring for legemiddelutvikling av mitokondriesykdommer er mangelen på effektive modeller som rekapitlerer det menneskelige sykdomsforløpet6. Flere av de for tiden studerte dyremodellene viser ikke de nevrologiske feilene som finnes hos pasientene7. Derfor er mekanismene som ligger til grunn for nevronpatologien til mitokondriesykdommer fortsatt ikke fullt ut forstått.
Nyere studier genererte iPSCer fra pasienter som er rammet av mitokondriesykdommer og brukte disse cellene til å skaffe pasientspesifikke nevronceller. For eksempel har genetiske defekter forbundet med mitokondriesykdommen, Leigh syndrom, vist seg å forårsake avvik i cellulær bioenergi 8,9, proteinsyntese10 og kalsium homeostase9,11. Disse rapportene ga viktige mekanistiske ledetråder om nevronnedsettelsen som forekommer i mitokondriesykdommer, og banet vei for narkotikaoppdagelse for disse uhelbredelige sykdommene12.
Todimensjonale (2D) kulturer muliggjør imidlertid ikke undersøkelse av den arkitektoniske kompleksiteten og den regionale organiseringen av 3D-organer13. For dette formål kan bruk av 3D-hjerneorganoider avledet fra pasientspesifikke iPSCer14 tillate forskere å få ytterligere viktig informasjon og dermed bidra til å dissekere hvordan mitokondriesykdommer påvirker utviklingen og funksjonen til nervesystemet15. Studier som bruker iPSC-avledede hjerneorganoider for å undersøke mitokondriesykdommer begynner å avdekke nevrodevelopmentale komponenter av mitokondriesykdommer.
Ryggmargsorganoider som bærer mutasjoner forbundet med mitokondriesykdommen, mitokondrie encefalopati, melkesyreose og slaglignende episoder syndrom (MELAS), viste defekt nevrogenese og forsinket motorisk nevrondifferensiering16. Kortikale organoider avledet fra pasienter med mitokondriesykdommen, Leigh syndrom, viste redusert størrelse, defekter i nevral epitelial knoppgenerering og tap av kortikale arkitektur17. Hjerneorganoider fra Leighs syndrompasienter viste at sykdomsfeilene initierer på nivået av nevrale stamceller, som ikke kan forplikte seg til mitokondriemetabolisme, forårsaker avvikende nevronal forgrening og morfogenese18. Dermed kan nevrale forfedre representere et cellulært terapeutisk mål for mitokondriesykdommer, og strategier som fremmer deres mitokondriefunksjon kan støtte den funksjonelle utviklingen av nervesystemet.
Bruken av hjerneorganoider kan bidra til å avdekke nevrodevelopmentale komponenter av mitokondriesykdommer. Mitokondriesykdommer anses hovedsakelig som tidlig nevrodegenerasjon5. Imidlertid er nevrodevelopmentale defekter også til stede hos pasienter som er rammet av mitokondriesykdommer, inkludert utviklingsforsinkelse og kognitiv svikt19. Pasientspesifikke hjerneorganoider kan bidra til å adressere disse aspektene og belyse hvordan mitokondriesykdommer kan påvirke menneskelig hjerneutvikling. Mitokondrie dysfunksjon kan også spille en patogenetisk rolle i andre mer vanlige nevrologiske sykdommer, som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntington sykdom4. Derfor kan det å belyse virkningen av mitokondriefeil i nevroutvikling ved hjelp av hjerneorganoider også være avgjørende for studiet av disse sykdommene. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for å generere reproduserbare hjerneorganoider som kan brukes til å utføre sykdomsmodellering av mitokondriesykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

Mitokondriesykdommer representerer den største klassen av medfødte feil i metabolismen og er for tiden uhelbredelig. Disse sykdommene forårsaker nevrodevelopmentale defekter hvis underliggende mekanismer gjenstår å bli belyst. En stor veisperring er mangelen på effektive modeller som rekapitlerer tidlig nevronsvikt sett hos pasientene. Fremskritt i teknologien for induserte pluripotente stamceller (iPSCer) muliggjør generering av tredimensjonale (3D) hjerneorganoider som kan brukes til å undersøke virkningen av sykdommer på utvikling og organisering av nervesystemet. Forskere, inkludert disse forfatterne, har nylig introdusert menneskelige hjerneorganoider for å modellere mitokondrieforstyrrelser. Denne artikkelen rapporterer en detaljert protokoll for robust generering av humane iPSC-avledede hjerneorganoider og deres bruk i mitokondriebioenergetiske profilerings- og bildeanalyser. Disse forsøkene vil tillate bruk av hjerneorganoider for å undersøke metabolske og utviklingsmessige dysfunksjoner og kan gi avgjørende informasjon for å dissekere nevronpatologien til mitokondriesykdommer.

Protokollen som er beskrevet her, letter robust generering av runde organoider (figur 1A). De genererte organoidene inneholder modne nevroner som kan visualiseres ved hjelp av proteinmarkører som er spesifikke for axoner (SMI312) og dendritter (mikrotubule-assosiert protein 2 (MAP2)) (figur 1B). Eldre organoider inneholder ikke bare nevronceller (MAP2-positive), men også glialceller (f.eks. positive for astroc...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Vi beskriver en detaljert protokoll for generering av menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede hjerneorganoider og deres bruk i modellering av mitokondriesykdommer.

Generering av humane hjerneorganoider for mitokondriesykdomsmodellering

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Denne protokollen tar sikte på å bruke hjerneorganoider for å studere mitokondriesykdommer. Den ble utviklet for å generere reproduserbare hjerneorganoider i vurderingen av deres mitokondrieegenskaper. Denne metoden krever ikke dyre bioreaktorer og tidkrevende innebyggingsprosedyrer.Derfor er det enkelt å implementere og oppskalere. Denne protokollen gjør det mulig å generere reproduserbare hjerneorganoider og teste deres mitokondrieegenskaper. Dette kan føre til identifisering av intervensjonsmål for ubehandlede mitokondrier sykdommer.Til å begynne med, kultur menneskelige iPSCs under feeder-frie forhold i iPSC medium på belagt seks-brønn plater og holde dem i en fuktet vev kultur inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Før iPSCene på 80 % samløp ved hjelp av enzymfritt avløsningsmedium i forhold fra en til fire til en etter 12. For å øke celleoverlevelsen, tilsett 10 mikromolar rho-assosiert proteinkinase eller ROCK-hemmer etter hver splitting.Ta avstand fra de 80 % iPSCene på dag null. Forbered kortikale differensieringsmedium en eller CDM1 og forvarm den ved romtemperatur før du legger den til cellene. Vask brønnene som inneholder iPSCene med PBS for å fjerne døde celler og rusk.Tilsett 500 mikroliter for oppvarmet reagens A til hver brønn og inkuber i fem minutter ved 37 grader Celsius. Kontroller under mikroskopet for å sikre celleavløsning. Tilsett en milliliter iPSC-medium for å fortynne reagens A for å nøytralisere aktiviteten.Bruk en 1000 mikroliter pipette for å fjerne cellene ved å røre opp og ned og overføre celleopphenget til et 15 milliliter sentrifugerør. Sentrifuger forsiktig iPSCene ved 125 ganger G i fem minutter ved romtemperatur, og aspirer deretter forsiktig supernatanten for å unngå å forstyrre cellepellet. Resuspend pellet med en milliliter CDM1 for å få en enkelt celle suspensjon og telle cellenummeret.Forbered såddmediet med 9000 iPSCer per 100 mikroliter i CDM1 supplert med 20 mikromolar ROCK-hemmere, tre mikromolar WNT cateninhemmer eller IWR-1, og fem mikromolar SB-431542. Tilsett 100 mikroliter sådd medium per brønn til en 96-brønns V bunnplate. Hold platen i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For å generere nevrosfærer, på dag én, observere at runde cellemengder med definerte glatte grenser dannes. Legg merke til de døde cellene rundt aggregatene. Fortsett å dyrke i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.På dag tre, rør platen ved å trykke på sidene tre ganger for å løsne døde celler, legg deretter til 100 mikroliter CDM1 supplert med 20 mikromolar ROCK-hemmer, tre mikromolar IWR-1 og fem mikromolar SB-431542 til hver brønn. Hold platen til inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. På dag seks fjerner du forsiktig 80 mikroliter av det supernatante mediet fra hver brønn.Unngå å berøre bunnen av brønnen. Tilsett 100 mikroliter CDM1 supplert med tre mikromolar IWR-1 og fem mikromolar SB-431542 til hver brønn og inkuber platen. Gjenta forrige trinn etter hver tredje dag til dag 18.På dag 18, for å overføre nevrosfærer, forberede CDM2 og legge til 10 milliliter til en 100 millimeter ultra lav vedlegg cellekulturplate. Bruk en 200 mikroliterpipette med spissen avskåret for å overføre de runde nevrosfærene fra 96-brønnsplaten til den 100 millimeter ultra lave festecellekulturplaten. Fjern fem milliliter medium fra platen som inneholder nevrosfærene og tilsett fem milliliter fersk CDM2.Plasser platen på en orbital shaker ved 70 rotasjoner per minutt inne i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Hver tredje dag aspirerer du forsiktig det overnaturlige mediet og erstatter det med fersk CDM2. La en liten mengde av mediet forhindre at nevrosfærer tørker ut.På dag 35 forbereder du CDM3. Aspirer mediet fra platen og tilsett 10 milliliter kald CDM3. Etter å ha skiftet medium, plasser platen tilbake på en orbital shaker ved 70 rotasjoner per minutt inne i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Endre mediet hver tredje til femte dag, avhengig av veksthastigheten som angitt av mediets farge. På dag 70 forbereder du CDM4. Bruk CDM4 medium til ønsket alder av organoider er nådd.I løpet av denne perioden, hold platen på en orbital shaker satt til 70 rotasjoner per minutt inne i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Endre mediet hver tredje til femte dag avhengig av vekstraten. Forbered 4%PFA-løsning og legg den under en sikkerhetshette.Samle hjerneorganoider og overfør dem forsiktig med en stump tippet tre milliliter plast Pasteur pipette til en seks-brønns plate fylt med PFA. Oppbevar organoidene i PFA-oppløsningen i en time ved romtemperatur. Fjern PFA forsiktig med en tre milliliter plast Pasteur pipette og vask de faste organoidene tre ganger ved hjelp av PBS.Oppbevar de faste organoidene ved fire grader Celsius i PBS inntil videre bruk. Organoidene som genereres ved hjelp av denne protokollen inneholder modne nevroner som kan visualiseres ved hjelp av proteinmarkører som er spesifikke for axoner og dendritter. Eldre organoider inneholder ikke bare nevronceller, men også glialceller.Ved hjelp av skiver hjerneorganoider analyse, er det mulig å overvåke SMI 312 positive axoner og MAP2 positive dendritter eller S100 beta glialceller. Videre bidrar konfiskere bilder til å undersøke detaljert distribusjon og organisering av SOX2 positive nevrale forfedre med hensyn til beta-3 tubulin positive nevroner. Hjerneorganoider ble farget for mitokondrispesifikke markører, for eksempel translocase av ytre membran eller TOM20.Bioenergetisk profilering av hjerneorganoider ble utført ved å måle både mitokondriemetabolismen ved hjelp av oksygenforbruket, eller OCR, og glykolytisk metabolisme ved hjelp av den ekstracellulære forsuringshastigheten, eller ECAR. Oligomycin forårsaker en nedgang i OCR-profilen og identifiserer derfor OCR som trengs for ATP-produksjon. Ved oligomycinbehandling kan det også være en kompenserende økning i ECAR som tyder på at cellene kan oppregulere glykolyse for å forhindre metabolsk stress.Når du overfører nevrosfærene fra 96-brønnsplaten til en kulturplate eller under festeprosedyren, er det viktig å håndtere organoidene forsiktig for å unngå å skade dem. Etter generering av hjerneorganoider ville multi-elektrode array eller kalsiumavbildning være ideelle metoder for å teste funksjonaliteten til organoidene.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitokondrielt Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

I Vivo Single-molekylet sporing på Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensjonal form modellering og analyse av hjernens strukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humane nevroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller for modellering av neuron-oligodendrococyttinteraksjoner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Generering av menneskelige motorenheter med funksjonelle nevromuskulære veikryss i mikrofluidiske enheter

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flowcytometrisk analyse av multiple mitokondrielle parametere i humaninduserte pluripotente stamceller og deres nevrale og gliaderivater

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Analysere Parkinsons sykdom Musemodell indusert av Adeno-assosierte Viral Vectors Koding Human α-Synuclein

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust og svært reproduserbar generering av kortikale hjerneorganoider for modellering av hjernens nevronale senescens in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...