Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Agradecemos a Miriam Bünning pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark e Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), the United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), e o Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) (e: Bio jovem investigador conceder AZ 031L0211 a A.P.). O trabalho no laboratório da C.R.R. foi apoiado pelo DFG (FOR 2795 "Sinapses sob estresse", Ro 2327/13-1).

NOTA: O uso de iPSCs humanos pode exigir uma aprovação ética. Os iPSCs utilizados neste estudo foram derivados de indivíduos de controle saudável após aprovação ética local (#2019-681). Todos os procedimentos de cultura celular devem ser realizados sob uma capa de cultura celular estéril, desinfetando cuidadosamente todos os reagentes e consumíveis antes de serem transferidos sob o capô. Os iPSCs humanos usados para diferenciação devem ter um número de passagem abaixo de 50 para evitar possíveis aberraç?...

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	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo.">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. 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C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

Este artigo descreve a geração reprodutível de organoides cerebrais derivados do iPSC humanos e seu uso para modelagem de doenças mitocondriais. O protocolo descrito aqui é modificado com base em um trabalho publicado anteriormente20. Uma grande vantagem do presente protocolo é que ele não requer a incorporação manual de cada organoide em uma matriz de andaimes. Na verdade, a solução matricial é simplesmente dissolvida no meio da cultura celular. Além disso, não há necessidade de em...

As doenças mitocondriais representam a maior classe de erros inatos do metabolismo1. São causadas por mutações genéticas que interrompem diferentes processos mitocondriais, incluindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)2, montagem da cadeia respiratória, dinâmica mitocondrial e transcrição ou replicação do DNA mitocondrial3. Tecidos com necessidades energéticas são particularmente afetados pela disfunção mitocondrial4. Assim, pacientes com doenças mitocondriais normalmente desenvolvem manifestações neurológicas precoces.
Atualmente, não há tratamentos disponíveis para crianças afetadas com doenças mitocondriais5. Um grande obstáculo para o desenvolvimento de medicamentos de doenças mitocondriais é a falta de modelos eficazes recapitulando o curso da doença humana6. Vários dos modelos animais atualmente estudados não apresentam os defeitos neurológicos presentes nos pacientes7. Assim, os mecanismos subjacentes à patologia neuronal das doenças mitocondriais ainda não são totalmente compreendidos.
Estudos recentes geraram iPSCs de pacientes afetados por doenças mitocondriais e usaram essas células para obter células neuronais específicas do paciente. Por exemplo, defeitos genéticos associados à doença mitocondrial, síndrome de Leigh, foram encontrados para causar aberrações em bioenergética celular8,9, síntese proteica10 e homeostase de cálcio9,11. Esses relatórios forneceram importantes pistas mecanicistas sobre o comprometimento neuronal que ocorre em doenças mitocondriais, abrindo caminho para a descoberta de medicamentos para essas doenças incuráveis12.
Culturas bidimensionais (2D), no entanto, não permitem a investigação da complexidade arquitetônica e da organização regional dos órgãos 3D13. Para isso, o uso de organoides cerebrais 3D derivados de iPSCs 14 específicos do paciente pode permitir que os pesquisadores obtenham informações importantes adicionais e, assim, ajudem a dissecar como as doenças mitocondriais impactam o desenvolvimento e a função do sistema nervoso15. Estudos que empregam organoides cerebrais derivados do IPSC para investigar doenças mitocondriais estão começando a descobrir os componentes neurodesenvolvimentista das doenças mitocondriais. 
Organoides medulares portadores de mutações associadas à doença mitocondrial, encefalopatia mitocondrial, acidose láctica e síndrome de episódios semelhantes a acidente vascular cerebral (MELAS), apresentaram neurogênese defeituosa e diferenciação retardada do neurônio motor16. Organoides corticais derivados de pacientes com a doença mitocondrial, síndrome de Leigh, apresentaram tamanho reduzido, defeitos na geração de brotos epiteliais neurais e perda de arquitetura cortical17. Organoides cerebrais de pacientes com síndrome de Leigh mostraram que os defeitos da doença iniciam-se ao nível das células progenitoras neurais, que não podem se comprometer com o metabolismo mitocondrial, causando ramificação neuronal aberrante e morfogênese18. Assim, os progenitores neurais podem representar um alvo terapêutico celular para doenças mitocondriais, e estratégias que promovam sua função mitocondrial podem apoiar o desenvolvimento funcional do sistema nervoso.
O uso de organoides cerebrais pode ajudar a descobrir os componentes neurodesenvolvimentos de doenças mitocondriais. As doenças mitocondriais são consideradas principalmente como neurodegeneração de início precoce5. No entanto, defeitos neurodesenvolvimentais também estão presentes em pacientes afetados por doenças mitocondriais, incluindo atraso no desenvolvimento e comprometimento cognitivo19. Organoides cerebrais específicos do paciente podem ajudar a abordar esses aspectos e elucidar como doenças mitocondriais podem afetar o desenvolvimento cerebral humano. A disfunção mitocondrial também poderia desempenhar um papel patogênico em outras doenças neurológicas mais comuns, como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a doença de Huntington4. Assim, elucidar o impacto dos defeitos mitocondriais no neurodesenvolvimento usando organoides cerebrais também pode ser fundamental para o estudo dessas doenças. Este artigo descreve um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais reprodutíveis que podem ser usados para a condução da modelagem de doenças mitocondriais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

As doenças mitocondriais representam a maior classe de erros inatos do metabolismo e são atualmente incuráveis. Essas doenças causam defeitos neurodesenvolvimentistas cujos mecanismos subjacentes permanecem a ser elucidados. Um grande obstáculo é a falta de modelos eficazes recapitulando o comprometimento neuronal de início precoce visto nos pacientes. Os avanços na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração de organoides cerebrais tridimensionais (3D) que podem ser usados para investigar o impacto das doenças no desenvolvimento e organização do sistema nervoso. Pesquisadores, incluindo esses autores, introduziram recentemente organoides cerebrais humanos para modelar distúrbios mitocondriais. Este artigo relata um protocolo detalhado para a geração robusta de organoides cerebrais derivados do iPSC humanos e seu uso em perfis bioenergénicos mitocondrial e análises de imagens. Esses experimentos permitirão o uso de organoides cerebrais para investigar disfunções metabólicas e de desenvolvimento e podem fornecer informações cruciais para dissecar a patologia neuronal de doenças mitocondriais.

O protocolo aqui descrito facilita a geração robusta de organoides redondos (Figura 1A). Os organoides gerados contêm neurônios maduros que podem ser visualizados usando marcadores proteicos específicos para axônios (SMI312) e dendritos (proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2)) (Figura 1B). Os organoides maduros contêm não apenas células neuronais (MAP2 positivos), mas também células gliais (por ...

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Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Este protocolo visa usar organoides cerebrais para estudar doenças mitocondriais. Foi desenvolvido para gerar organoides cerebrais reprodutíveis na avaliação de suas propriedades mitocondriais. Este método não requer bioreatores caros e procedimentos de incorporação demorados.Portanto, é fácil de implementar e upscale. Este protocolo permite gerar organoides cerebrais reprodutíveis e testar suas propriedades mitocondriais. Isso pode levar à identificação de alvos intervencionistas para doenças mitocôndrias intratáveis.Para começar, cultura iPSCs humanos em condições livres de alimentadores em meio iPSC em placas revestidas de seis poços e mantê-los em uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Passagem os iPSCs em 80% de confluência usando meio de desprendimento livre de enzimas em proporções que variam de um por quatro para um por 12. Para aumentar a sobrevida celular, adicione 10 proteínas associadas a micromolar quinase ou inibidor de ROCHA após cada divisão.Dissociar os 80% de iPSCs no dia zero. Prepare o meio de diferenciação cortical ou CDM1 e pré-aqueça-o à temperatura ambiente antes de adicioná-lo às células. Lave os poços que contêm os iPSCs com PBS para remover células mortas e detritos.Adicione 500 microliters de reagente pré-aquecido A a cada poço e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Verifique sob o microscópio para garantir o desprendimento celular. Adicione um mililitro de meio iPSC para diluir o reagente A para neutralizar sua atividade.Use uma pipeta de 1.000 microliter para dissociar as células encanando as células, encanando para cima e para baixo e transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar suavemente os iPSCs a 125 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernatante para evitar perturbar a pelota celular. Resuspende a pelota com um mililitro de MDL1 para obter uma única suspensão celular e contar o número do celular.Prepare o meio de semeadura com 9.000 iPSCs por 100 microliters em CDM1 suplementado com 20 inibidores de ROCK micromolar, três inibidores de catenin WNT micromolar ou IWR-1, e cinco micromolar SB-431542. Adicione 100 microliters de meio de semeadura por poço a uma placa inferior V de 96 poços. Mantenha a placa em uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para gerar neuroesferas, no primeiro dia, observe que agregados de células redondas com bordas lisas definidas estão se formando. Note as células mortas ao redor dos agregados. Continue a cultura na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No terceiro dia, agitar a placa tocando nas laterais três vezes para desprender células mortas, em seguida, adicione 100 microliters de MDL1 complementado com 20 inibidores de ROCK micromolar, três micromolar IWR-1, e cinco micromolar SB-431542 para cada poço. Mantenha a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No sexto dia, remova cuidadosamente 80 microliters do meio sobrenatante de cada poço.Evite tocar na parte inferior do poço. Adicione 100 microliters de MDL1 complementados com três micromolar IWR-1 e cinco micromolar SB-431542 para cada poço e incubar a placa. Repita a etapa anterior após cada três dias até o dia 18.No dia 18, para transferir neurosferas, preparar o MDL2 e adicionar 10 mililitros a uma placa de cultura celular de 100 milímetros ultra baixa. Use uma pipeta de 200 microliter com a ponta cortada para transferir as neurosferas redondas da placa de 96 poços para a placa de cultura celular de 100 milímetros ultra baixa. Remova cinco mililitros de meio da placa contendo as neurosferas e adicione cinco mililitros de CDM2 fresco.Coloque a placa em um agitador orbital a 70 rotações por minuto dentro de uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A cada três dias, aspire cuidadosamente o meio supernante e substitua-o por cdm2 fresco. Deixe uma pequena quantidade do meio para evitar que as neurosferas sequem.No dia 35, prepare o CDM3. Aspire o meio da placa e adicione 10 mililitros de CDM3 frio. Depois de mudar o meio, coloque a placa de volta em um agitador orbital a 70 rotações por minuto dentro de uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Mude o meio a cada três ou cinco dias, dependendo da taxa de crescimento indicada pela cor do meio. No dia 70, prepare o CDM4. Use o meio CDM4 até que a idade desejada dos organoides seja alcançada.Durante este período, mantenha a placa em um agitador orbital a 70 rotações por minuto dentro de uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Mude o meio a cada três ou cinco dias, dependendo da taxa de crescimento. Prepare a solução 4%PFA e coloque-a sob um capô de segurança.Colete organoides cerebrais e transfira-os suavemente com uma pipeta pasteur de três mililitros de plástico para uma placa de seis poços cheia de PFA. Mantenha os organoides na solução PFA por uma hora em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o PFA com uma pipeta Pasteur de plástico de três mililitros e lave os organoides fixos três vezes usando PBS.Armazene os organoides fixos a quatro graus Celsius em PBS até uso posterior. Os organoides gerados usando este protocolo contêm neurônios maduros que podem ser visualizados usando marcadores proteicos específicos para axônios e dendritos. Organoides maduros contêm não apenas células neuronais, mas também células gliais.Usando a análise de organoides cerebrais fatiados, é possível monitorar os axônios positivos SMI 312 e dendritos positivos MAP2 ou as células gliais beta S100. Além disso, imagens confocal ajudam a investigar a distribuição detalhada e organização de progenitores neurais positivos SOX2 em relação aos neurônios positivos da tubulina beta-3. Organoides cerebrais foram manchados para marcadores específicos de mitocôndrias, como translocase de membrana externa ou TOM20.O perfil bioenergénico dos organoides cerebrais foi realizado medindo ambos os metabolismos mitocondriais usando a taxa de consumo de oxigênio, ou OCR, e o metabolismo glicóltico usando a taxa de acidificação extracelular, ou ECAR. A oligomicina causa uma queda no perfil OCR e, portanto, identifica o OCR necessário para a produção de ATP. Após o tratamento da oligomiecina, também pode haver um aumento compensatório no ECAR sugerindo que as células podem aumentar a glicólise para evitar o estresse metabólico.Ao transferir as neurosferas da placa de 96 poços para uma placa de cultura ou durante o procedimento de fixação, é crucial manusear os organoides suavemente para evitar danificá-los. Seguindo a geração de organoides cerebrais, matriz multi-eletrodo ou imagem de cálcio seriam métodos ideais para testar a funcionalidade dos organoides.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

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Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Neurociência

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Modelagem e análise tridimensional da forma de estruturas do cérebro

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Analisando o modelo de rato da doença de Parkinson induzida por vetores virais associados à Adeno codificando α-sinucleína humana

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...