Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר השוודית (2018-02843), קרן המוח (Fo 2019-0140), הקרן למחלות גריאטריות במכון קרולינסקה, קרן גונוור ויוסף אנר, קרן מגנוס ברגוולס, קרן אקדח וברטל סטונס, קרן טורה נילסון למחקר רפואי, קרן מרגרטה af Ugglas והקרן למשרתים זקנים.

הערה: מבט כולל על פרוטוקול זה מוצג באיור 2.
1. ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 (איור 2A)
<ol><li>
פלסמידים הערה: להשיג שיבוטים cDNA עבור FKBP51 אנושי (מזהה שיבוט: 5723416) עבור FKBP52 אנושי (מזהה שיבוט: 7474554) מקונסורציום IMAGE.<ol>
<li>להגביר את ה- DNA FKBP51 האנושי ?...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות בדיקה לבדיקה עבור סינון מולקולות קטנות מעכב אינטראקציות בין Hsp90 ו TPR-מוטיב מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. ציון ה-Z הגבוה שלו (>0.8) מדגים את החוסן והאמינות לפורמט בעל תפוקה גבוהה. התוצאות ניתן להשיג בתוך שעה אחת, כמויות קטנות של חרוזים, חלבון ותרכובות נדרשים. ?...

מלווים מולקולריים תורמים להומאוסטזיס של חלבונים, כולל קיפול חלבונים, הובלה והשפלה. הם מווסתים מספר תהליכים תאיים ומקושרים למחלות רבות כגון סרטן ומחלות ניווניות1. חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא אחד המלווים החשובים ביותר שתפקידם תלוי בשינויים קונפורמיטיביים המונעים על ידי הידרוליזה ATP וקשירה עם חלבוני לקוח בתיווך המלווים השותפים שלה2. למרות הפוטנציאל הברור של Hsp90 כיעד הטיפולי, כוונון עדין של תפקידו מהווה אתגר גדול. ישנם מספר מעכבי Hsp90 המתמקדים באזור איגוד ה- ATP של N-terminal, אשר הוערכו בניסויים קליניים, אך אף אחד מהם לא אושר לשיווק3. בשל היעדר כיס4, המתמקדבאזור ה-C-terminal של Hsp90, זכה להצלחה מוגבלת4. לאחרונה, הפרעה של אינטראקציות Hsp90-cochaperone על ידי מולקולות קטנות נחקרה כאסטרטגיהחלופית 5. מיקוד אינטראקציות Hsp90-cochaperone לא לעורר תגובת מתח תא כללי ומספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים שונים. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטראטריאופפטייד (TPR) של מלווים משותפים6. מתוך 736 חלבונים המכילים מוטיב TPR המובאים במאגר החלבון האנושי, ~ 20 חלבונים שונים אינטראקציה עם Hsp90 באמצעות פפטידזה 7. מולקולות המתחרות על כריכת הפפטיד של MEEVD ישבשו את האינטראקציות בין Hsp90 למלווים שותפים המכילים תחום TPR. אתר כריכת הפפטידים בעל מבנה שלישוני דומה, אך ההומולוגיה הכוללת בין תחומי מוטיב TPR שונים נמוכה יחסית7, ומספקת הזדמנות לזהות מולקולות המסוגלות במיוחד לחסום אינטראקציות בין Hsp90 לבין מלווים משותפים מסוימים של TPR-מוטיב. בין אלה TPR-מוטיב מלווים משותפים, FK506 מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם רגולטורים של קולטן הורמון סטרואידים (SHR) איתות מעורב במספר מחלות תלויות הורמונים סטרואידים כולל סרטן, מחלות הקשורות ללחץ, מחלות מטבוליות, ומחלתאלצהיימר 8. למרות FKBP51 ו- FKBP52 מניות > דמיון רצף 80%, הפונקציות שלהם שונים: FKBP52 הוא רגולטור חיובי של פעילות SHR, בעוד FKBP51 הוא רגולטור שלילי ברוב המקרים8. לכן, זיהוי מולקולות, במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52, מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח למחלות קשורות.
 Luminescent Proximity Hאומוגנוס Assay (אלפא מסך) פותח לראשונה בשנת 1994 על ידי אולמן EF ואח'9. עכשיו הוא נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות סוגים שונים של אינטראקציות ביולוגיות, כגון פפטיד10, חלבון11, DNA12,RNA13, וסוכר14. בטכניקה זו, ישנם שני סוגים של חרוזים (קוטר 200 ננומטר), אחד הוא חרוז התורם והשני הוא חרוז הקבלה. הביומולקולים משותקים על החרוזים האלה; האינטראקציות הביולוגיות שלהם מביאות את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. מכיוון שלחמצן הסינגל יש חיים קצרים, הוא יכול לפזר רק עד 200 ננומטר. אם חרוז הקבלה נמצא בסמיכות, נגזרת תיוקסן שלה מגיבה עם חמצן יחיד יצירת chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז מקבל לפלוט אור ב 520-620 ננומטר15. אם האינטראקציות הביולוגיות משובשות, החרוז המקבל וחרוז התורם אינם יכולים להגיע לקרבה, וכתוצאה מכך דעיכה בחמצן יחיד ואות המיוצר נמוך.
כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות טכניקה זו להקרנת מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות בין Hsp90 ל- TPR מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. 10 פפטידים ארוכים של חומצות אמינו המתאימים ל- Hsp90 C-terminus קיצוני מחוברים לחרוזים מקובלים. מלווים שותפים TPR מתויגים GST אינטראקציה עם חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון. כאשר האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב-Hsp90 לבין מלווים שותפים של TPR-מוטיב מאחדת את החרוזים, נוצר אות מוגבר(איור 1A). אם המולקולות הקטנות המוקרנות יכולות לעכב את האינטראקציות בין Hsp90 ל-TPR-מוטיב שותפים, האות המוגבר הזה יקטן (איור 1B). ניתן לחשב את IC50 שלהם לפי מדידה כמותית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לכל מלווה - אינטראקציות שיתוף המלווה TPR-מוטיב של עניין והוא בעל חשיבות רבה בפיתוח של מולקולות חדשניות, במיוחד חסימת האינטראקציה בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> איור 1: העיקרון הבסיסי של ההסתה הזו. (A)GST-FKBP51 מטוהר מקיים אינטראקציה עם חרוזי תורמים הקשורים לגלוטתיון. 10 פפטידים ארוכים של חומצת אמינו המתאימים לטרמינל C הקיצוני של Hsp90 מחוברים לחרוזים מקובלים. האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב- Hsp90 לבין תחום TPR של FKBP51 מביאה את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. נגזרת תיוקסן על חרוז הקבלה מגיבה עם חמצן יחיד ומייצר chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז קבלה לפלוט אור ב 520-620 ננומטר. (B)כאשר מולקולות קטנות מעכבות את האינטראקציות בין Hsp90 ל- FKBP51, החרוזים התורמים והמקבלים אינם יכולים להגיע לקרבה. ואז החמצן היחיד עם ריקבון תוחלת חיים קצרה, ולא מיוצר אות לגילוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

מיקוד חלבון הלם חום 90 (Hsp90)-cochaperone אינטראקציות מספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים תלוי Hsp90. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטרטריקופטיד (TPR) של מלווים משותפים. FK506-מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם שני מלווים שותפים TPR-מוטיב דומה המעורבים במחלות תלויות הורמונים סטרואידים עם פונקציות שונות. לכן, זיהוי מולקולות במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו FKBP51 או FKBP52 מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח עבור מספר מחלות אנושיות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור קרבה זוהרת מוגברת כדי לחקור אינטראקציות בין Hsp90 ושותפו מלווים FKBP51 ו- FKBP52. ראשית, טיהרנו את החלבונים המכילים מוטיב TPR FKBP51 ו- FKBP52 בצורת גלוטתיון S-transferase (GST). באמצעות חרוזי התורם הקשורים לגלוטתיון עם חלבוני TPR-מוטיב מותכים GST וחרוזים מקבלים יחד עם פפטיד מסוף C 10-mer של Hsp90, חקרנו אינטראקציות חלבון חלבון בסביבה הומוגנית. השתמשנו בבדיקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש את האינטראקציות Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 וזיהינו מעכבי אינטראקציה חזקים וסלקטיביים Hsp90-FKBP51.

בבדיקה שלנו, יחס ה-Z וה-S/B הם 0.82 ו-13.35, בהתאמה (איור 3A),מה שמוכיח שבדיקת ה-Assay שלנו חזקה ואמינה להקרנה בתפוקה גבוהה. לאחר מכן השתמשנו בו כדי לסנן תרכובות מסה מולקולרית קטנות. איור 3B מציג עיכוב תלוי מינון של אינטראקציות קואצ'אפרון מלווה עם מולקולה קטנה שנבחרה (D10). ?...

Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

פרוטוקול זה מציג טכניקה לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון עם מלווים שותפים TPR-מוטיב מותך GST וחרוזים מקובלים יחד עם פפטיד שמקורו Hsp90. השתמשנו בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 אינטראקציות וזיהינו מעכבי אינטראקציה Hsp90-FKBP51 חזקים וסלקטיביים.

מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

בנינו בחינה הומוגנית המבוססת על חרוזים כדי לחקור אינטראקציות בין מלווה לקוצ'מלון. באמצעות טכניקה זו, אנו מסננים מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות בין Hsp90 ל- FKDP51 או FKBP52 ומזהות מעכבים חזקים וסלקטיביים. טכניקת סינון תפוקה גבוהה זו היא חזקה ואמינה.התוצאות ניתן להשיג בתוך שעה אחת, וזה דורש רק כמויות קטנות של חלבון חרוזים ותרכובות. אינטראקציה Hsp90 עם cochaperones זה היה מעורב בהפרעות אנושיות, כגון מחלת אלצהיימר, סרטן, מחלה אוטואימונית. טכניקה זו מספקת את ההזדמנות לסנן מעכבי cochaperone מלווה עם חשיבות רפואית גבוהה.הנה העיקרון הבסיסי של ההסתה הזאת. כאשר האינטראקציה בין Hsp90C-Terminal פפטיד לתחום TPR של cochaperones מביא את התורם ואת חרוזים הקבלה לקרבה, אות מוגבר מאוד נוצר. כאשר מעכבי האינטראקציה מתווספים, התורם וחרוזים מקבלים לא יכולים להגיע לקרבה, ולא מיוצר אות לגילוי.התחל על ידי דילול פפטיד Hsp90 ב- PBS בריכוז מיליגרם אחד למיליליטר. לדלל את חרוזי הקבלה ללא מנונים ב- PBS, ולהעביר את החרוזים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגות החרוזים מדוללים לשטיפה, ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant.להטיות, הגדר את חרוזי הקבלה בפפטידים ביחס של 10 ל -1. לחרוזים הפאלטיד בפפטיד מדולל PBS, פתרון Tween 20 ונתרן ציאנבורוהידריד, ודגרו עם תסיסה מקצה לקצה על שייקר סיבובי. כדי לחסום את האתרים שלא נפרעו, להוסיף 20 microliters של פתרון הידרוכלוריד טוחנת אחת של pH 8.0 לחרוזים, ולהרוות את התגובה על ידי דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ולהשעות מחדש את גלולה חרוזים במיליליטר אחד של פתרון טריס הידרוכלוריד. חזור על הכביסה פעמיים נוספות. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את החרוזים בריכוז מיליגרם אחד למיליליטר במאגר אחסון ולאחסן את פתרון חרוז הקבלה מצומד ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.הוסף חרוזי תורם גלוטתיון בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. הוסף GSTFKBP51 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ודגר את התגובה במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס בחושך. הפוך דילול טורי של תרכובת הבדיקה ב- DMSO.מוסיפים 0.25 מיקרוליטרים של דילול תרכובת בדיקה ומשולשים בפינה של כל באר של צלחת 384 באר. לשליטה שלילית, הוסיפו 0.25 מיקרוליטרים של DMSO ולשליטה חיובית, הוסיפו 0.25 מיקרוליטרים של פפטיד Hsp90 C-Terminal בבארות. הוסיפו 22.5 מיקרוליטרים של הפתרון המכיל חרוזי תורם גלוטתיון עם חלבונים מתויגים GST לכל באר.לנער את הצלחת ביסודיות עם הידיים ודגרה בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לדלל את החרוזים הקבלה עם פפטיד Hsp90C-Terminal המצורפת ל 100 מיקרוגרם לריכוז מיליליטר בריכוז של פי 0.5 PBS. הוסיפו 2.25 מיקרוליטרים של חרוזי קבלה מדוללים לכל באר.לנער ולדגירה את הצלחת בחושך במשך 15 דקות כפי שהוכח. הפעל את כלי קורא הלוחות, מדוד את האות של הצלחת וניתח את הנתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט. צור טבלת נתונים X-Y בתיבת הדו-שיח של הפתיחה, בחר מספרי X, Y והזן שלושה ערכים משוכפלים בעמודות זו לצד זו.ייבא את ערכי הריכוז לעמודת X וערכי האות לעמודה Y. לחץ על נתח, בחר שינוי צורה בריכוז X ולאחר מכן בחר המרה ללוגריתמים. לחץ על נתח ובחר רגרסיה לא ליניארית תחת ניתוח X-Y.פתח את אפשרות עיכוב תגובת המינון ובחר יומן רישום לעומת משוואת שיפוע משתנה תגובה. לחץ על אישור כדי להציג את התוצאות המכילות ערך IC50 וגרפים. בדיקה זו שימשה להקרנת מולקולות קטנות, עיכוב אינטראקציות בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52.ציון Z של יותר מ- 0.8 ויחס איתות לרקע של 13.35, מדגימים את החוסן והאמינות להקרנת תפוקה גבוהה. ההשפעה של תרכובת בדיקת משקל מולקולרית קטנה D10 על עיכוב של אינטראקציות cochaperone מלווה הוערך וערכי IC50 חושבו, שם D10 הראה עיכוב תלוי מינון. ערך IC50 עבור אינטראקציות Hsp90 GSTFKBP51 היה 65 ננומולר.בעוד שעבור Hsp90, אינטראקציות GSTFKBP52, עיכוב מלא לא הושג עם הריכוז המורכב הגבוה ביותר מציין כי עיכוב סלקטיבי של אינטראקציה חלבון חלבון עם מולקולות קטנות ניתן להשיג. השלב הקריטי הוא סדר התוספת. ראשית אנו יוצרים קומפלקס בין מולקולה קטנה לבין יעד ה-TPR שלה.אחרת נדרשים דגירה ארוכה יותר וריכוזים מורכבים גבוהים יותר. אנו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות המשבשות את האינטראקציה בין Hsp90 ו- FKB51 או Hsp90 ו- FKB52. זה יכול גם להיות מורחב לכל אינטראקציה בין Hsp90, Hsp70 ומוטיב TPR המכיל מעכבי סלקטיביים הקרנת cochaperone.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...